Biology

В пробирке FluoroBlok опухолевой инвазии Пробирной

Published: July 20, 2009 doi: 10.3791/1475

Summary

В этом видеоролике показано, как измерить ячейки вторжения через клеточные культуры вставками использованием флуоресценции основе методологии.

Abstract

Отличительной чертой метастатических клеток является их способность к вторжению через базальную мембрану и мигрировать в другие части тела. Клетки должны быть в состоянии и выделяют протеазы, которые расщепляют базальной мембраны, а также миграцию, чтобы быть агрессивным. BD BioCoat опухолевой инвазии Система обеспечивает клетки с условиями, которые позволяют оценить их инвазивных собственности

Protocol

После маркировки и измерения с использованием BD кальцеин AM флуоресцентного красителя

Клетки помечены для количественного после того как они вторглись через BD Матригель Матрицы и пропускается через мембраны BD FluoroBlok. В результате, только конечная точка измерения клеточного вторжения могут быть получены.

Расти клетки ~ 80% слияния.
Подготовка и увлажняет вставить системе.
1. Удалите пакет от -20 ° C хранения и дайте ему прийти к комнатной температуре.
2. Открытый пакет фольги и добавить 500 мкл теплой (37 ° C) СМИ интерьера вставки скважин. Разрешить пластину увлажняет в течение 2 часов при температуре 37 ° C, 5% СО _2.
  Примечание: нет необходимости увлажняет немелованной BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставьте системы, которая будет использоваться в качестве контроля миграции клеток.
3. После регидратации, осторожно удалите среды от вставки скважин, не нарушая слой BD Матригель Матрица на мембране. Система готова к использованию.
Подготовка клеточные суспензии по trypsinizing ячейки монослоев и ресуспендирования клеток в бессывороточной DMEM на 5 х 10 ^{4 клеток} / мл.
Примечание: Если вы используете другой тип клеток необходимо определить оптимальную плотность посева. Для определения оптимальной плотности посева для вашего типа клеток на пористой поверхности роста, использование диапазона плотности посева (клеток / см ^2), что скобки плотности посева используются на непористых поверхностях (например, фляги, блюда и тарелки). Например, если вы в настоящее время семена на уровне 2,5 х 10 ^{5 клеток} / см ^2, семян при различных концентрациях между ячейками 5 × 10 ⁴ и 5 х 10 ^{5 клеток} / см ² для определения оптимальной начальной плотности посева.
Добавить 500 мкл клеточной суспензии (2,5 х 10 ^{4 клеток)} в апикальной камер.
Добавить 750 мкл хемоаттрактант (5% ЭТС в DMEM) к каждому из базального камеры, используя образец порты для доступа.
Инкубируйте опухоли BD BioCoat системы Вторжение и немелованной BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставьте пластины на 20-22 часов при 37 ° C, 5% СО ₂ атмосферы.
После инкубации, осторожно удалите среды от апикальной камер. Это может быть достигнуто, вытряхнув содержимое в контейнер для отходов. Не прикасайтесь к нижней поверхности вставки системы.
Передача вставить системы во второй 24-луночного планшета, содержащую 500 мкл / лунку 4 мкг / мл кальцеин AM в HBSS. Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C, 5% СО _2. Решение кальцеин AM не удаляется из нижней палаты, прежде чем читать флуоресценции, потому что это жизненно nonfluorescent краситель, который превращается в зеленого флуоресцентного кальцеин по цитозольного эстераз.
Флуоресценция вторглись в клетках читается на длинах волн 494/517 нм (Ex / Ет) на дно чтения читатель флуоресцентные пластины. Установка усиления, возможно, должны быть определены эмпирически, но середина усиления должна быть достаточной отправной точкой. Установка усиления, что слишком высокая может привести к насыщению детектор с высокой флуоресцентные пробы; это может помешать приобретению значимых результатов. Использование AutoGain (если поддерживается вашим читателем) не рекомендуется. Перевернутой флуоресцентного микроскопа может быть использована для проверки ваших результатов, это особенно полезно, чтобы сделать это в первый раз вы запустите этот анализ.
Примечание: Крайне важно, чтобы Вставить системы можно прочитать с помощью правильную карту пластины. Для получения информации о загрузке карты пластины видеть BD Технический бюллетень № 436 от www.bdbiosciences.com или свяжитесь с BD Техническая поддержка (labware@bd.com). Правильная ориентация пластина с хорошо A1 в левом верхнем углу и логотип BD Флакон ориентированных на право, как пластина вставляется в считыватель.

Сжатие данных

Данные выражается в следующей формуле:
Уравнение
Фон может быть вычтен до расчета процентов вторжение ячейки
РФС = относительная флуоресцентные единиц.

Disclosures

Авторы являются сотрудниками BD Biosciences, которая производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD BioCoat Tumor Invasion System	BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells	ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control	BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye	BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling	BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities	PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. , 113-2003 (2009).
Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. , 177-5612 (2006).
Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).
An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. , 6,740,501,B2 (2004).
Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds. Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).
Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).
Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).