Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Summary

Se presenta un

Abstract

La fusión de membranas es un paso esencial en la entrada de los virus envueltos en las células. Ensayos convencionales de fusión suelen informar sobre un gran número de eventos de fusión, por lo que es difícil de analizar cuantitativamente la secuencia de los pasos moleculares que intervienen. Hemos desarrollado una in vitro, de dos colores ensayo de fluorescencia para controlar la cinética del virus de la única fusión de partículas con una doble capa de destino en un soporte esencial líquido.

Partículas virales de la gripe se incuban con un fluoróforo verde lipofílico para teñir la membrana y un fluoróforo rojo hidrófilo para manchar el interior viral. Depositamos una bicapa lipídica que contienen gangliósidos en la superficie del vidrio dextrano functionilized de una celda de flujo, incubar las partículas virales en la bicapa plana y la imagen de la fluorescencia de un 100 x 100 m ^{2 Superficie,} que contiene varios cientos de partículas, en un CCD cámara. Por imágenes tanto de la fluorescencia roja y verde, que al mismo tiempo puede controlar el comportamiento de la membrana de colorante (verde) y el contenido acuoso (rojo) de las partículas.

Al bajar el pH a un valor inferior al pH de fusión, las partículas se fusionan con la membrana. Hemifusion, la fusión de la hoja exterior de la membrana viral con la hoja exterior de la membrana de destino, será visible como un repentino cambio en la fluorescencia verde de una partícula. Tras la posterior fusión de los dos folletos distal restante un poro se formará y el fluoróforo rojo que emiten en la partícula viral se dará a conocer en la membrana blanco. Este acontecimiento dará lugar a una disminución de la fluorescencia de color rojo de las partículas individuales. Finalmente, la fluorescencia de un fluoróforo integrados sensibles al pH que se incrusta en la membrana de destino informa sobre la hora exacta de la caída del pH.

De las tres de fluorescencia a tiempo las huellas, todos los eventos importantes (disminución del pH, mezcla de lípidos en hemifusion, el contenido de la mezcla sobre la formación de poros), ahora se puede extraer de una manera directa y para cada partícula individual. Mediante la recopilación de los tiempos transcurridos para las diversas transiciones de muchas partículas individuales en los histogramas, se puede determinar la vida útil de los productos intermedios correspondientes. Incluso intermedios ocultos que no tienen un observable fluorescentes directos pueden ser visualizados directamente de estos histogramas.

Protocol

Cubierta de vidrio antideslizante funcionalización

La bicapa plana utilizada en el ensayo de fusión es compatible con una película hidratada de dextrano. Dextrano actúa como un espaciador entre las dos capas planas y superficie de cristal. Esto evita que los componentes de la membrana de ser atrapado en la superficie del cristal y también proporciona un espacio para que el contenido de una partícula de virus puede escapar a la fusión. Cubreobjetos de vidrio son funcionalizados mediante el tratamiento con una resina epoxi de silano, que nos permite adhieren químicamente dextrano al vidrio (Elender, et al. 1996).

1. Organizar 25 mm cubreobjetos en una gradilla de tinción de cerámica, y colocar el bastidor en una jarra o un vaso.
2. Llene el recipiente con una solución al 10% de grado de laboratorio detergente cristalería. Coloque el recipiente en un limpiador ultrasónico durante 30 minutos.
3. Enjuagar el recipiente y el estante portaobjetos con agua destilada, y rellenar con hidróxido de postassium 1M. Devolver el contenedor al baño de ultrasonido durante 30 minutos.
4. Repita este procedimiento de limpieza con acetona y etanol.
5. Enjuague el coverlips en agua y seco.
6. Por último, limpiar los cubreobjetos con un separador de plasma de oxígeno durante tres minutos.
7. El paso de la última limpieza se oxida la superficie, haciendo que el cristal de manera uniforme hidrofílicos y reactivos en los pasos siguientes silanización.
8. Prepare una solución al 0,2% de 3-glycidoxypropyltrimethoxy silano en isopropanol. Sumerja el cubreobjetos en esta solución durante cinco minutos.
9. Deseche la solución de silano y enjuague varias veces cubreobjetos en isopropanol.
10. El cubreobjetos están recubiertas con una capa de silano, pero deben ser curadas para permitir que el silano de unión covalente con el vidrio. Coloque el cubreobjetos en un horno a 80 grados centígrados durante una hora.
11. Mientras que el cubreobjetos se cura, se pesarán dextrano 500 y preparar un 30% w / v solución. El precalentamiento del agua ayudará a la disolución. Vamos a utilizar aproximadamente 1 ml de esta solución por tapar. Una vez que el dextrano se ha disuelto, desairear la solución en un desecador de vacío.
12. Cuando el cubreobjetos silanizada haya terminado el curado, sacarlos de la parrilla de cerámica y colocarlos apoyados en el interior de una caja de plástico para congelar. Use una pipeta de 1 ml para cubrir la superficie superior de cada cubreobjetos con ~ 1 ml de la solución de dextrano. Cerrar el cuadro de congelador y déjelo en un lugar tranquilo para 24-36 horas.
13. Mientras sujeta el cubreobjetos con unas pinzas de plástico, vierte el exceso de dextrano y vuelva a colocar en el frontal de cerámica. Enjuagar varias veces el cubreobjetos en agua, y permitir que el cubreobjetos en remojo en agua durante 48 horas. El frasco se agita suavemente en un rotor de mesa.
14. Seque el cubreobjetos en un horno a 80 grados centígrados y almacenar en un desecador de vacío.

Preparación de liposomas

Apoyado bicapas lipídicas se forman mediante la adsorción de liposomas para un cubreobjetos dextrano funcionalizados. El adsorbido liposomas se fusionan con la membrana entre si hasta que se rompe y se extiende sobre la superficie plana.

1. Una formulación típica liposoma utilizado en el ensayo se compone de 1,2, dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), el colesterol, el cerebro de la especie bovina Disialoganglioside (GD _{1 bis),} y N-(6 (- (biotinoyl) amino) hexanoilo) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina en una proporción de 4:4:2:0.1:5 x10 ^-5. Todos los componentes están almacenados en cloroformo o cloroformo y soluciones de metanol.
2. Prepare una mezcla que contiene dos micromoles de lípidos mediante la transferencia de volúmenes de cada componente en un tubo de ensayo de vidrio. Se evapora el solvente bajo una corriente de argón o nitrógeno. Eliminar el disolvente restante, dejando el tubo de ensayo en un desecador al vacío durante dos horas.
3. Resuspender la película de lípidos se seca en 400 microlitros de tampón HNE (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).
4. Transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga de plástico. Congelar la suspensión en un baño de nitrógeno líquido y descongelación en un baño de agua tibia. Repita este ciclo de congelación / descongelación en cuatro ocasiones.
5. Montar una extrusora de lípidos con un 100 nm filtro de membrana de policarbonato, y la extrusión de la suspensión de lípidos 25 veces. La suspensión debe aparecer para ser más transparente después de la extrusión.
6. Los liposomas se debe utilizar en el día en que se preparan. Se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su uso.

Flujo de microfluidos preparación de células

Una simple célula de flujo de microfluidos se hace intercalando cinta adhesiva doble entre un portaobjetos de cuarzo y un portaobjetos funcionalizado.

1. Obtener una diapositiva mm 20x20x3 cuarzo. Utilice una fresa de diamante para perforar dos agujeros de 1 mm en los lados opuestos.
2. Corte un cuadrado de 20 mm de una lámina de cinta adhesiva doble, y una hoja de afeitar, cortar una sección de 15 x 2 mm del centro.
3. Pele un lado de la cinta de respaldo, y cumplir la cinta hasta el cuartoz de diapositivas. Se adhieren al otro lado de un cubreobjetos funcionalizados.
4. Cortar dos de 20 cm de longitud de tubería de polietileno y los insertan en los agujeros en la diapositiva de cuarzo.
5. Sello de la celda de flujo con pegamento epóxico de 5 minutos.
6. Cuando el pegamento ha curado, el primer celular y el flujo de la tubería con el tampón.
7. Una bicapa lipídica apoyo se pueden formar en esta etapa de la elaboración de aproximadamente 80 microlitros de la suspensión de liposomas en los canales.

Virus etiquetado de partículas

1. H3N2 de la gripe A (X-31) se suele utilizar para el ensayo de fusión, pero otras cepas de gripe y otros virus han utilizado con éxito.
2. Virus se etiqueta con un máximo de dos tintes fluorescentes diferentes para permitir la detección de hemifusion y formación de poros.
3. Disolver sulforodamina b (SRB) en tampón HNE para hacer una solución de 20 mM. Combine 20 microlitros de la solución de colorante con 10 microlitros de la suspensión viral, y dejar a temperatura ambiente durante 20 horas. Durante este período, el tinte poco a poco se acumulan dentro de las partículas del virus.
4. Retire el exceso de colorante al pasar la suspensión de virus a través de una columna PD-10 desalación. Si el material viral se usa suficiente, una banda de color se puede ver en la columna. Esta banda contiene virus de la etiqueta y se pueden recoger, ya que se eluye.
5. Si la banda no es visible, recogen fracciones de 200 microlitros y determinar qué fracciones contienen la etiqueta del virus mediante la medición de la absorción de 565 nm en un espectrofotómetro. El virus debe eluir en un volumen total de aproximadamente 0,8 ml.
6. Etiqueta de la envoltura viral mediante la adición de 13 microlitros de una formamida 2 mM de dimetilo (DMF), solución de octadecilo rodamina 110 (Rh110C18) a la suspensión de virus SRB etiquetados.
7. Agite la suspensión por colocar el tubo a un rotor de laboratorio y se deja durante 3 horas.
8. Purificar el virus del exceso Rh110C18 con un PD-10 columna de la desalación como se ha descrito antes.

Microscopio de configuración

El experimento se realiza en un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de inmersión en alta NA aceite adecuado para el total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna. Los 488 y 568 nm de las líneas de un láser de argón / kriptón gas se utiliza para excitar el virus Rh110C18 SRB y etiquetados. Imágenes simultáneas de cada etiqueta se logra mediante el fraccionamiento de la emisión de fluorescencia verde y rojo con un espejo dicroico y centrarse de forma independiente las imágenes en mitades separadas de un electrón de multiplicar la cámara CCD.

Realizar el ensayo

Ejecución de la fusión de ensayo consiste en un conjunto de pasos de los componentes bioquímicos en la celda de flujo: el montaje de la bicapa lipídica plana, de acoplamiento de las partículas de virus marcado, cubriendo la superficie con fluoresceína, y el inicio de la reacción con el buffer de pH bajo (Figura 1) .

1. Montar la celda de flujo en la platina del microscopio, y conectar la tubería de salida de una bomba de jeringa establecido en el flujo a una velocidad de 40 microlitros por minuto.
2. Borrar los canales de flujo de los liposomas por el exceso de fluido en 300 microlitros de la ENH.
3. Enfocar el microscopio y ajustar la potencia del láser para iluminar la superficie con 350 W / cm ² de luz de 488 nm y 70 W / cm ² nm de luz 568. Si usted está usando un 1.45 NA objetivo 60x de inmersión en aceite, ajustar la intensidad de láser de 100 vatios y 20 vatios micro micro, respectivamente.
4. Bomba de virus marcado (diluido 1 / 100) en una celda de flujo. A medida que el virus se difunde a la superficie inferior del canal de flujo, las partículas comienzan a pegarse a los gangliósidos incorporados en la bicapa lipídica.
5. Cuando una densidad adecuada de partículas de virus acoplado se ha alcanzado (hasta alrededor de 1000 partículas por campo de visión). Cambiar la tubería de entrada a una solución que contiene dos microgramos por mililitro estreptavidina marcada con fluoresceína. La estreptavidina marcada se une a la biotina unido moléculas de lípidos en la bicapa, y, finalmente, un fondo verde oscuro será visible.
6. Lave el canal de flujo con 300 microlitros de la ENH.
7. Elija un área de imagen, enfocar el microscopio y preparar la cámara CCD para la adquisición de la imagen del tiempo transcurrido. Establecer el tiempo de exposición a 100 ms y recoger imágenes a una velocidad de 10 Hz.
8. Iniciar la fusión por las corrientes en un tampón ácido que contiene 10 mM de citrato sódico y 140 mM de NaCl. El pH de la solución debe ser ajustado por debajo del pH crítico de los virus que se analizaron. X-31 fusibles con un pH por debajo de 5,5.

Resultados representante

La figura 1B muestra instantáneas de bicapa viriones atracado antes y durante la fusión. Cada punto de difracción limitada representa una partícula de virus individuales. Red y la fluorescencia verde se han separado imágenes en las mitades superior e inferior de una cámara CCD, que permite la observación simultánea de la envoltura viral y etiquetas de contenido. Normalmente hay el doble de puntos en el canal verde en comparación conel rojo, lo que refleja la menor eficiencia de etiquetado por el tinte de contenido en comparación con la etiqueta envolvente. La fluorescencia de fondo verde emitida por la superficie límite fluoresceína desaparece a la llegada de la solución tampón de citrato y permite determinar la hora de inicio de la reacción de fusión. Hemifusion eventos se detectan como ráfagas de fluorescencia de color verde como el apagado Rh110C18 en la cubierta del virus se difunde a través del tallo hemifusion y se diluye en la membrana plana. Una nube en expansión hacia el exterior fluorescentes se pueden ver alrededor de las partículas hemifused, lo que demuestra la libre difusión del colorante-acil grasos unidos en la membrana plana. La formación de poros se observa como la decadencia de la fluorescencia roja de SRB atrapado en el interior de las partículas virales. La apertura de un poro de fusión permite que la tinta se escape al espacio acuoso por debajo de la bicapa plana y fuera de la región de observación.

Trayectorias de intensidad de fluorescencia para cada partícula, trazada a partir de las intensidades integradas de las partículas individuales, facilitar la determinación del rendimiento y los tiempos de hemifusion y la formación de poros (Fig. 1C). Veces Hemifusion y la formación de poros caso se determinará como el punto donde la pendiente máxima de un estallido Rh110C18 fluorescencia o la decadencia SRB señal. En un experimento exitoso, un 50 por ciento de las partículas marcadas con señales Rh110C18 dequenching rendimiento, y un 30 por ciento de las partículas SRB etiquetados dar señal útil. De las partículas marcadas con ambos colorantes, aproximadamente el 10 por ciento muestran las dos señales de la formación de mezcla de lípidos y de los poros.

Fig. 2A-C muestra la distribución de hemifusion y los tiempos de formación de poros retraso de un experimento típico. Fig.2D-F muestra la distribución de eventos de eventos combinados de cinco experimentos realizados en las mismas condiciones. Incluso con un modesto número de observaciones, la forma de los histogramas es evidente. Debido a que cada experimento se sincroniza con la detección de los casos la disminución del pH, los experimentos se pueden combinar y obtener información detallada sobre la limitación de velocidad pasos intermedios se pueden obtener.

Figura 1. El diseño experimental. A) Las partículas virales se marcan con dos tintes fluorescentes para controlar la cinética de hemifusion y la formación de poro de fusión. La fluorescencia es recogida por un objetivo de microscopio de alto NA y la imagen en un CCD. B) Imágenes de fluorescencia antes (izquierda) y durante (derecha) la fusión de las partículas virales individuales. Mitad superior e inferior de cada imagen corresponden a la fluorescencia roja y verde, respectivamente, de la misma área de ~ 50 x 100 mm ² de la bicapa de apoyo. C) La intensidad de la fluorescencia del marcador rojo SRB contenido viral (traza superior), el verde Rh110C18 membrana tinte (en el centro de seguimiento), y el sensor de pH de fluoresceína (traza inferior) ofrecen tiempos exactos transcurridos entre la caída de pH, hemifusion, y la fusión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.

Figura 2. Cinética de fusión del virus de la etiqueta fluorescente. Distribuciones del tiempo transcurrido entre la caída del pH y hemifusion (A, D) y la formación de poros (B, E). El auge y la decadencia de las distribuciones de indicar la presencia de varios pasos intermedios. La transición entre hemifusion y la apertura de un poro de fusión de las partículas individuales se distribuyen de manera exponencial, lo que sugiere un solo paso limitante. Los paneles AC muestran los resultados de un solo experimento. DF paneles se compilan a partir de cinco experimentos independientes realizados en las mismas condiciones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.

Discussion

Preparación de fluido y continuo apoyo bicapa lipídica puede ser un reto. Trazas de contaminación de los defectos de material o superficie prevenir la propagación de bicapas. Su limpieza y deposición de una capa uniforme de dextrano son esenciales.

Imagen prolongada de partículas del virus pueden blanquear los marcadores fluorescentes o hacer que se inactiva. Foto-daño de este tipo es muy conocido en la bio-imágenes y campos de una sola molécula y se cree generalmente que se derivan de la generación de especies reactivas del oxígeno por los fluoróforos excitados. Para minimizar el foto-daño, por lo general, reducir al mínimo la potencia del láser de excitación y evitar la exposición prolongada antes de comenzar el experimento. Agotamiento del oxígeno de los topes con uno de los sistemas de oxígeno de varios basureros informó pueden resultar útiles.

La capacidad de obtener información acerca de los estados transitorios intermedios requiere que la reacción de fusión con precisión sincronizado. El caudal utilizado y el volumen muerto de la tubería de entrada y el canal de la celda de flujo son factores que pueden limitar la sincronización. La fusión se inicia mediante el intercambio de neutral para el buffer de pH ácido. Sin embargo, como el tampón ácido viaja por el tubo de entrada en la celda de flujo, la interfaz entre los dos buffers se mezcla a través de la difusión y se hace cada vez menos definidos. El gradiente de pH resultantes en la superficie de dos capas tiende a desdibujar la determinación de la hora de inicio. Además, puesto que la fusión cinética depende de la concentración de protones, un gradiente de pH en el inicio del experimento podría complicar la interpretación de los resultados. En el experimento se demuestra aquí, la cinética de la fusión es mucho más lento que el tiempo de transición de pH, y el efecto de gradiente no afecta significativamente la cinética de la fusión. Actualmente estamos trabajando en las modificaciones a las células de nuestro flujo que nos permita preparar el tubo de admisión con el buffer deseado antes de desviar el flujo en la celda de flujo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning cover glass squares, 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS286525
Fused silica slides	Technical Glass
Staining rack	Thomas Scientific	8542E40
(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane	Gelest Inc.	SIG5840.1
Dextran T-500	Pharmacosmos	5510 0500 4006
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850375
1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850457
Cholesterol	Avanti Polar Lipid, Inc	700000
N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)	Invitrogen	B1616
Streptavidin, fluorescein conjugate	Invitrogen	S-869
Disialoganglioside GD1a from bovine brain	Sigma-Aldrich	G2392
Mini Extruder	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
0.1 micron polycarbonate membrane filters	Whatman, GE Healthcare	800309
10 mm drain discs (membrane supports)	Whatman, GE Healthcare	230300
Sulforhodamine b sodium salt		S1402
Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)			See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol
PD-10 desalting columns	GE Healthcare	17-0851-01
Nikon fluorescence microscope	Nikon Instruments	TE2000-U
Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective	Nikon Instruments
Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser	Coherent Inc.
Syringe Pump	Harvard Apparatus	702213