Summary
لدراسة فعالية وظيفة الخلايا المناعية للسكان هو مطلوب في كثير من الأحيان لتنقية بهم. نضوب تكمل هي تقنية سريعة وغير مكلفة لعزل السكان الخلايا المناعية مع درجة نقاوة عالية.
Abstract
مطلوب في كثير من الأحيان لتنقية الخلايا المناعية للسكان من أجل دراسة وظائفها الفريدة. في النهج ، ولا سيما الجزيئية مثل PCR الوقت الحقيقي وتحليل [ميكروأري تتطلب عزل السكان الخلية مع نقاء عالية. استراتيجيات تشمل تنقية استخداما الفلورسنت الفرز تنشيط الخلية (FACS) ، والفصل المغناطيسي حبة ونقص المتممة. من الاستراتيجيات الثلاث ، واستنفاد تكملة يوفر مزايا يجري بسرعة ، وغير مكلفة ، لطيف على الخلايا والخلايا عالية الغلة. ويتألف النظام من استكمال عدد كبير من بروتينات البلازما أنه عندما يشرع في تنشيط بروتين تتالي بلغت ذروتها في تشكيل مجمع غشاء الهجوم الذي يشكل المسام على سطح الخلية مما يؤدي إلى موت الخلايا
Protocol
ألف أرنب المتممة
- وينبغي أن تكمل الأسهم إذابة أرنب في درجة حرارة الغرفة ، وبعد ذلك في aliquoted 0.5 و / أو وحدات التخزين 1 مل -20-80 والمجمدة في درجة مئوية لمدة طويلة الأجل للتخزين.
- وينبغي لكل معاير الكثير من تكملة لتحديد تركيز العمل الأمثل. عادة ، والتخفيف من 1:10 حتي 1:20 هو الأمثل.
- لا يكمل الأرنب presterilized دائما قبل بيعها ، اعتمادا على الاستخدام النهائي للخلايا ، ينبغي تصفية تعقيم عندما تكمل aliquoted والمجمدة أو قبل بالإضافة إلى الخلايا.
باء جسم التحديد
- ليس كل الأجسام المضادة فعالة في تنشيط تكمل ، وبالتالي يجب أولا أن يتم اختبار الأجسام المضادة للنشاط.
- كل من الفأر والجرذ خريطة موقع فعالة في تنشيط المتممة.
- أضداد الغلوبولين المناعي عادة ما تكون الأكثر كفاءة لاستخدامها في استكمال تحلل الخلايا التي يسببها تلاه مفتش الحكومة. وisotypes مفتش أفضل لتفعيل تكمل تختلف بين الأنواع.
- وينبغي لكل معاير الضد للاستخدام الأمثل في مناطق ذات كثافة خلية من خلايا 7 10 / مل.
جيم البروتوكول الأساسي
- ضبط خلية السكان بدأوا 5 × 10 7 خلايا / مل في المتوسط تحتوي على السفح الحرارة المعطل. والحجم النهائي للخلايا يكون ضعف حجم انطلاق. تذكر لانقاذ بعض الخلايا بحيث يمكن قياسها كميا للنضوب.
- وينبغي أن يضاف إلى كل الأضداد تعليق خلية في تركيز مناسب محدد سلفا أو التخفيف. مزيج جيد من قبل خلايا قلب.
- حساب كمية تكمل الحاجة. تحسن الأسهم تكمل في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم استكمال عقيمة ، تعقيم باستخدام بروتين منخفض طرف الحقنة ملزمة التصفية. إلى المحقنة ، إضافة مل العديد من المتوسط قبل إضافة تكملة وتصفية مباشرة في أنبوب يحتوي على الخلايا والأجسام المضادة.
- ضبط حجم النهائي في الأنبوب بحيث الخلايا هي الخلايا في 1 × 7 10 / مل.
- احتضان الخلايا على 37 درجة مئوية لمدة ساعة ، وخلط كل 15 دقيقة.
- الطرد المركزي الخلايا وتجاهل طاف.
- يغسل مع المتوسط مرتين. سوف حطام خلية العصا إلى جانب أنابيب البوليسترين. ويمكن التخلص من الخلايا الميتة والحطام باستخدام مصفاة الخلية أو عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة.
- التحقق من نقاء الخلية بمقارنة السكان خلية من الفائدة قبل وبعد نضوب. التدفق الخلوي والمناعية هما طرق جيدة لتحديد نقاء الخلية.
ممثل النتائج
عند استخدام خريطة موقع الذي يتم كفاءة عالية في تفعيل استنفاد تكملة الخلية ، وبعد جولة واحدة أكبر ثم 95 ٪. هذا هو مبين في الشكل 1 حيث بدأنا مع splenocytes الماوس تتألف من 32.2 ٪ في الخلايا التائية αβ الكشف عنها بواسطة التعبير عن TCRβ (eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا) التي التدفق الخلوي. نحن المنضب الخلايا التائية باستخدام خريطة موقع لThy1 محددة ، وهو بروتين التي أعربت عنها جميع الخلايا التائية ، ولكن ليس غيرها من الكريات البيض. كان الضد كنا Y - 19 فأرا IgG2c 2. ووصف الإجراء التالي ، تم تخفيض عدد السكان TCRβ إلى 1.56 ٪ ، مما يمثل انخفاضا أكبر من 95 ٪.
الشكل 1. نضوب thy1 + تم الحصول عليها من قبل الخلايا التائية الطحال تنشيط المتممة. splenocytes بواسطة الماوس إجمالي تجانس الطحال وتحلل من RBC. أضيفت مكافحة thy1 والطفل تكمل الأرنب بتركيزات محددة سلفا على تعليق خلية واحدة من هذه splenocytes أن تركيز الخلية النهائية 1 × 10 7 خلايا / مل. بعد حضانة لمدة 1 ساعة إلى 37 درجة مئوية ، وكانت تغسل الخلايا مرتين وتقييمها من قبل الاستبعاد التريبان الأزرق للبقاء الخلية. تم تقييم كفاءة من قبل استنفاد التدفق الخلوي مقارنة النسبة المئوية للخلايا + TCRβ قبل استنفاد (اللوحة اليسرى) وبعد استنفاد (اللوحة اليمنى). شريط أفقي يشير إلى تلطيخ إيجابية وعدد من فوق العارضة في المئة ايجابية.
Discussion
عملية تنقية للسكان الخلية هو إجراء المشتركة اللازمة لدراسة وظائفها. نحن هنا وصف طريقة سريعة وفعالة للأوزون السكان الخلية باستخدام مستضد محددة الأضداد ونقص المتممة. لا يمكن أن يتحقق استنفاد أية مجموعة من السكان الخلية إذا كان الضد - تكمل تفعيل متاح للعلامة محددة النسب. وأعرب بروتين هنا أثبتنا استنفاد الخلايا التائية باستخدام خريطة موقع لThy1 محددة ، وذلك أساسا جميع السكان الخلايا التائية. المنضب لدينا أكثر من 95 ٪ من الخلايا التائية αβ وزيدت splenocytes المتبقية من 68 ٪ إلى 98 ٪. هذا المستوى من النقاء الخلية استراتيجيات مماثلة لتنقية الأخرى بما في ذلك نظام مراقبة الأصول الميدانية والانفصال حبة المغناطيسي. نضوب تكمل هي تقنية السريعة التي يمكن أن يؤديها في 1.5 ساعة مرة واحدة يتم الحصول على السكان خلية البداية. ميزة أخرى لاستنفاد تكملة هو أن أي مختبر يمكن أن تؤدي هذه التقنية لأنها لا تتطلب معدات باهظة الثمن والكواشف. القطع الكبير الوحيد المعدات المطلوبة هي حمام الماء وأجهزة الطرد المركزي ملف. يمكن شراؤها يكمل الأرنب من مجموعة متنوعة من الباعة بتكلفة معقولة (انظر الجدول الكواشف) ويمكن شراؤها من العديد من خريطة موقع ATTC والمنتجة محليا للسيطرة على التكاليف. في المقابل ، FACS يتطلب تدفق عداد الكريات مع قدرة على فرز الخلية التي ستكلف في الأرقام الستة ومكلفة خريطة موقع الموسومة fluorescently. الفصل المغناطيسي هو حبة بأسعار معتدلة ، ولكن يتطلب شراء المغناطيس والخرز المغناطيسي ، والتي يمكن أن تكون مكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، بعض استراتيجيات الفصل المغناطيسي حبة يتطلب أيضا شراء من الأعمدة.
وحجر العثرة الاساسي هو لاستخدام تكملة لنضوب الخلية هو توافر تكمل تفعيل خريطة موقع مع خصوصية المستضد اللازمة. على الرغم من أن الإنسان ، والفأر والجرذان الأضداد جميعا القدرة على استكمال الإصلاح ، وبعض isotypes هي أفضل من غيرها. على الرغم من الغلوبولين المناعي من جميع الأنواع الثلاثة هي فعالة للغاية في تحديد تكمل isotypes مفتش تختلف. يجب أولا ومن ثم يتم اختبار كل خريطة موقع في دراسة تجريبية لتحديد مدى فعاليته. عن الأجسام المضادة التي ليست ذات كفاءة عالية ، يمكن إجراء جولتين من استنفاد تكملة دون التأثير على سلامة السكان الخلايا المتبقية. كما وفورات في التكاليف ، ينبغي معاير الأجسام المضادة للفعالية المثلى. بالإضافة إلى ذلك ، أن الأجسام المضادة المستخدمة لا تحتاج إلى تنقية. supernatants ورم هجين واستسقاء السوائل فقط العمل بشكل فعال ، وهو أمر مريح خصوصا للأضداد الغلوبولين المناعي ، والتي هي صعبة لتنقية. كما هو الحال مع الأضداد ، فمن المحتم أن يكون مكملا معاير في الدراسة التجريبية. وهناك تركيز عال جدا يؤدي الى فقدان قابلية للسكان الخلية غير المستهدفة. المهم أيضا هو أن فترة حضانة لا تتجاوز 60 دقيقة.
في بروتوكول لدينا ، فقد شاركنا في احتضان هذه الأضداد وتكمل معا. ومع ذلك ، يمكن أن توصف الخلايا مع الأجسام المضادة لل15-30 دقيقة ويغسل قبل إضافة متممة. عند استخدام هذه الاستراتيجية ، للتأكد من تنفيذ حضانات الأضداد على الجليد لمنع فقدان الخلية المستضد على سطح الخلية ، كما يحدث مع بعض البروتينات التي ترميم وتغطية أو استيعاب مستقبلة. على الرغم من كفاءة عالية ، والعيب الرئيسي لاستكمال استنزاف بالمقارنة مع الأساليب الأخرى هو أنه لا يمكن استخدامها لاختيار ايجابية. وبالتالي فمن الصعب الحصول على مجموعات سكانية فرعية من الخلايا. على سبيل المثال ، سيكون من الصعب تطهير المنطقة الهامشية خلايا من خلايا B B الجريبي ، والتي من الأفضل أن يقوم به نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذه الحالة ، يمكن أن تستخدم لتنشيط تكملة تستنفد خلايا تي للحد من عدد الخلايا التي تم فرزها. وهذه الاستراتيجية تقليل الوقت الفرز ، التي من شأنها توفير المال وستكون أقل قسوة على الخلايا.
منذ تنقية خلية معينة من السكان هو مطلب مشترك وضعت عددا من الاستراتيجيات. المزايا الرئيسية للاستراتيجية مكملة لها القدرة على تحمل التكاليف ونضوب ، بساطة التقنية وتوفير الوقت.
Acknowledgments
وأود أن أشكر Sreemanti باسو لتقديم البيانات عن الشكل 1. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح AI069358 ومؤسسة البحوث BloodCenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | |
| Water bath | Various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
References
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
