דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

Summary

כדי ללמוד ביעילות את הפונקציה של אוכלוסיות תאים חיסוניים טיהור שלהם נדרש לעתים קרובות. דלדול משלים היא טכניקה מהירה וזולה עבור בידוד של אוכלוסיות תאים חיסוניים עם טוהר גבוהה.

Abstract

טיהור של אוכלוסיות תאים חיסוניים נדרש לעתים קרובות כדי ללמוד פונקציות הייחודיים שלהם. ב, גישות מסוים מולקולרית כגון בזמן אמת PCR וניתוח microarray דורשים בידוד של אוכלוסיות תאים עם טוהר גבוהה. אסטרטגיות טיהור נפוצים כוללים תא פלורסנט מיון מופעל (FACS), הפרדה חרוז מגנטי דלדול משלימים. מבין שלוש אסטרטגיות, דלדול משלימים מציע את היתרונות של להיות מהר, לא יקר, עדין על תאים תא תשואה גבוהה. המערכת השלמה מורכבת ממספר רב של חלבונים פלזמה שכאשר מופעל ליזום מפל proteolytic שהגיעה לשיאה היווצרות של מורכבות קרום התקף המהווה הנקבוביות על פני שטח התא והתוצאה היא מוות של תאים

Protocol

א השלימו את הארנב

1. ארנב משלימים במלאי יש להפשיר בטמפרטורת החדר, ואת aliquoted מכן לתוך 0.5 ו / או 1 מ"ל כרכים קפואים ב -20-80 מעלות לאחסון ארוך טווח.
2. הרבה כל אחד משלים צריך להיות טיטרציה כדי לקבוע את ריכוז העבודה האופטימלית. בדרך כלל, דילול של 1:10-01:20 הוא אופטימלי.
3. משלימים הארנב אינו presterilized תמיד לפני המכירה, בהתאם לשימוש הסופי של התאים, להשלים את צריכה להיות מסוננים מעוקרים כאשר aliquoted קפואים או לפני כן על התאים.

ב בחירה נוגדן

1. לא כל הנוגדנים יעילים בכל ההפעלה משלימים, ולכן נוגדנים תחילה להיבדק על הפעילות.
2. שניהם עכבר חולדה MAB יעילים בכל ההפעלה משלימים.
3. נוגדני IgM הם בדרך כלל היעילה ביותר לשימוש תמוגה-Induced משלימים תא ואחריו IgG. Isotypes IgG ההפעלה הטובה ביותר עבור להשלים להשתנות בין המינים.
4. נוגדן כל צריך להיות טיטרציה לשימוש אופטימלי בצפיפות תא של 10 ⁷ תאים / מ"ל.

ג יסוד פרוטוקול

1. התאם את אוכלוסיית התאים מתחילים 5 x 10 ⁷ תאים / מ"ל במדיום חום FCS המכיל מומת. היקף הסופי של התאים יהיה כפול נפח ההתחלה. זכור לשמור כמה תאים כך דלדול ניתן לכמת.
2. כל נוגדן יש להוסיף את ההשעיה התא בריכוז הדילול מראש תקין או. מערבבים היטב את התאים על ידי היפוך.
3. לחשב את כמות משלימים הצורך. ההפשרה המניות משלימות בטמפרטורת החדר. אם משלימים אינו סטרילי, לעקר אותו באמצעות חלבון נמוך מחייב מזרק מסנן קצה. כדי המזרק, להוסיף כמה מ"ל של מדיום לפני תוספת של להשלים את ולסנן ישירות לתוך שפופרת המכילה את התאים נוגדנים.
4. התאמת עוצמת השמע הסופי בצינור כך התאים ב 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל.
5. דגירה התאים ב 37 ° C למשך שעה אחת, ערבוב כל 15 דקות.
6. צנטריפוגה את התאים להתעלמות supernatant.
7. לשטוף עם המדיום פעמיים. פסולת התא ידבק לצד צינורות קלקר. תאים מתים ופסולת ניתן למנוע בעזרת מסננת התא או על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.
8. בדוק את תא טוהר על ידי השוואה בין אוכלוסיית תאים של עניין לפני ואחרי דלדול. Cytometry זרימה אימונוהיסטוכימיה שתי שיטות טובות קביעת טוהר התא.

נציג תוצאות

בעת שימוש MAB היא היעילה ביותר בכל הפעלה, משלימים דלדול תא אחרי סיבוב אחד גדול אז 95%. זה שמוצג באיור 1 בו התחלנו עם splenocytes העכבר מורכב בתאי T 32.2% αβ כפי זוהה על ידי ביטוי TCRβ (eBioscience, סן דייגו, קליפורניה) על ידי cytometry הזרימה. אנחנו מתרוקנים שתאי T ספציפיים באמצעות מב עבור Thy1, חלבון לידי ביטוי כל ותאי T, אבל לא לויקוציטים אחרים. הנוגדן השתמשנו היה Y-19 עכברוש IgG2c ^2. בעקבות ההליך המתואר, האוכלוסייה TCRβ צומצם 1.56%, ירידה גדולה יותר מאשר 95%.

באיור 1. דלדול thy1 ⁺ בתאי T הטחול על ידי הפעלת המשלים. Splenocytes עכבר סך הכל התקבלו על ידי homogenization של הטחול ואת תמוגה של RBC. Anti-thy1 ו ארנב תינוק משלימים בריכוזים מראש נוספו ההשעיה תא בודד של splenocytes כזה ריכוז התא האחרון היה 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל. לאחר הדגרה במשך שעה 1 ב 37 ° C, התאים נשטפו פעמיים הוערכו על ידי הרחקה trypan כחול כדאיות התא. היעילות של דלדול הוערכה על ידי זרימת cytometry השוואת אחוז + תאים TCRβ לפני דלדול (פאנל משמאל) לאחר דלדול (פאנל מימין). הפס האופקי מציין מכתים חיובי ומספר מעל הבר הוא אחוז חיובי.

Discussion

טיהור של אוכלוסיות תאים היא הליך שכיח נדרש ללמוד את תפקידם. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה של depleting אוכלוסיות תאים באמצעות אנטיגן ספציפי לערמונית נוגדנים דלדול משלימים. דלדול האוכלוסייה בכל תא ניתן להשיג אם נוגדן משלימים-הפעלת זמין סמן מסוים בשושלת. כאן אנו הדגימו את דלדול של תאים T באמצעות ספציפי עבור MAB Thy1, חלבון לידי ביטוי בעצם כל אוכלוסיות תאים טי. אנחנו מתרוקנים מעל 95% של תאים T αβ ואת splenocytes הנותרים עלה מ% 68 ל% 98. רמה זו של תא טוהר דומה אסטרטגיות טיהור אחרים, כולל FACS והפרדה חרוז מגנטי. דלדול משלים היא טכניקה מהירה שניתן לבצע ב 1.5 שעות פעם את האוכלוסייה התא החל מתקבל. יתרון נוסף של דלדול משלימים זה במעבדה כל יכול לבצע את הטכניקה, כי היא אינה דורשת ציוד יקר ריאגנטים. רק החלקים העיקריים של הציוד הנדרש הם אמבט מים צנטריפוגות. משלימים הארנב ניתן לרכוש ממגוון רחב של ספקים במחיר סביר (ראה טבלה של ריאגנטים) ו מב רבים ניתן לרכוש ATTC גדל באופן מקומי כדי לשלוט בעלויות. לעומת זאת, FACS דורש cytometer לזרום עם קיבולת מיון התא יעלה בששת דמויות MAB מתויג fluorescently יקר. הפרדה חרוז מגנטי במחיר בינוני, אך דורש רכישת מגנט, חרוזים מגנטיים, אשר יכול להיות יקר. בנוסף, כמה אסטרטגיות מגנטי ההפרדה חרוז גם דורשים רכישה של עמודות.

אבן הנגף העיקרית לשימוש משלימים עבור דלדול התא הוא הזמינות של השלמה עם הפעלת MAB סגוליות את האנטיגן הנדרשת. למרות נוגדנים אנושיים עכבר חולדה כל יש את היכולת לתקן משלימים, isotypes כמה טובים יותר מאחרים. למרות IgM מכל שלושה מינים הוא יעיל מאוד בתיקון להשלים את isotypes IgG להשתנות. כך מב כל חייב להיות הראשון נבדק במחקר ניסיוני כדי לקבוע את יעילותו. עבור נוגדנים שאינם היעילה ביותר, שני סבבים של דלדול משלימים ניתן לבצע מבלי להשפיע על הכדאיות של אוכלוסיות תאים הנותרים. כמו חיסכון בעלויות, נוגדנים יש טיטרציה עבור יעילות אופטימלית. בנוסף, נוגדנים בשימוש לא צריכים להיות מטוהרים. Hybridoma supernatants ו מיימת עבודה נוזל בדיוק כמו יעילה, אשר נוח במיוחד עבור נוגדנים IgM, אשר קשה לטהר. כמו עם הנוגדנים, קיים הכרח כי המשלים להיות טיטרציה במחקר פיילוט. ריכוז גבוה מדי תגרום לאובדן של הכדאיות של הלא ממוקד אוכלוסיות תאים. חשוב גם הוא כי זמן דגירה אינו עולה על 60 דקות.

בפרוטוקול שלנו, אנחנו עמיתים דגירה הנוגדנים ואת משלימים ביחד. עם זאת, התאים יכולים להיות מתויג עם נוגדן עבור 15-30 דקות, לשטוף לפני תוספת של השלמה. כאשר משתמשים באסטרטגיה זו, הקפד לבצע את incubations נוגדן על הקרח כדי למנוע אובדן של האנטיגן התא על פני התא, כפי שקורה עם חלבונים מסוימים על ידי תיקון ו מכסת או הפנמה הקולטן. למרות היעילה ביותר, החיסרון העיקרי כדי להשלים את דלדול בהשוואה לשיטות אחרות היא שזה לא יכול לשמש סלקציה חיובית. לכן קשה להשיג subpopulations של תאים. לדוגמה, קשה יהיה לטהר את שולי B אזור תאים תאים B פוליקולרית, אשר היה הטוב ביותר לעשות זאת על ידי FACS. במצב זה, הפעלת המשלים יכול לשמש כדי לרוקן בתאי T כדי להפחית את מספר התאים להיות מיון. אסטרטגיה זו תפחית את הזמן למיין, אשר היה לחסוך כסף יהיה פחות קשות על התאים.

מאז הטיהור של אוכלוסיות תאים ספציפיים היא דרישה נפוצה מספר אסטרטגיות פותחו. היתרונות העיקריים של האסטרטגיה דלדול משלימים הם, בפשטות שלה affordability טכני חיסכון בזמן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-4 week baby rabbit complement	Pel-Freez Biologicals	31061-3
Water bath	Various	various	An incubator set at 37 °C can also be used.