Summary
Para estudiar con eficacia la función de las poblaciones de células inmunes a menudo es la purificación necesaria. El agotamiento del complemento es una técnica rápida y barata para el aislamiento de las poblaciones de células inmunes de alta pureza.
Abstract
La purificación de las poblaciones de células inmunes se requiere a menudo con el fin de estudiar sus funciones exclusivas. En determinados enfoques, molecular como PCR en tiempo real y análisis de microarrays de requerir el aislamiento de las poblaciones de células con alta pureza. Comúnmente utilizado estrategias de purificación son fluorescentes clasificación de células activadas (FACS), la separación de esferas magnéticas y el agotamiento del complemento. De las tres estrategias, el agotamiento del complemento ofrece la ventaja de ser rápido, barato, suave con las células y una producción de células de alta. El sistema del complemento se compone de un gran número de proteínas plasmáticas que cuando se activa iniciar una cascada proteolítica que culminó en la formación de un complejo de la membrana de ataque que forma un poro en la superficie de una célula que resulta en la muerte celular
Protocol
A. Complemento de Conejo
- Complemento de archivo de conejo se deben descongelar a temperatura ambiente, y luego en alícuotas de 0,5 y / o volúmenes de 1 ml y congelado a -20 a 80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
- Cada lote de complemento se titula para determinar la concentración óptima de trabajo. Normalmente, una dilución de 1:10-1:20 es óptima.
- Complemento de conejo no siempre es esterilizado antes de su venta, en función del uso final de las células, el complemento debe ser filtrada esterilizada y congelada en alícuotas o antes de la adición a las células.
B. Selección de anticuerpos
- No todos los anticuerpos son eficaces en la activación del complemento, por lo tanto los primeros anticuerpos debe ser probado para la actividad.
- Ratón y rata MAB son eficaces en la activación del complemento.
- Anticuerpos IgM son generalmente los más eficaces para su uso en la lisis celular inducida por el complemento seguido de IgG. Los isotipos IgG mejor para la activación del complemento varía entre las especies.
- Cada anticuerpo se debe ajustar para un uso óptimo a una densidad celular de 10 7 células / ml.
C. Protocolo Básico
- Ajuste la población de células a partir de 5 x 10 7 células / ml en medio del calor que contiene FCS inactivado. El volumen final de las células será el doble del volumen inicial. Recuerde guardar algunas células, de modo que el agotamiento puede ser cuantificado.
- Cada anticuerpo se debe agregar a la suspensión celular en la concentración adecuada determinado o la dilución. Mezcla de las células mediante la inversión.
- Calcular la cantidad de complemento necesario. Descongele las acciones complementan a temperatura ambiente. Si el complemento no es estéril, esterilizar usando una proteína de baja unión filtro punta de la jeringa. A la jeringa, añadir algunos mililitros de medio antes de la adición del complemento y el filtro directamente en el tubo que contiene las células y anticuerpos.
- Ajustar el volumen final en el tubo de modo que las células son de 1 x 10 7 células / ml.
- Se incuban las células a 37 ° C durante una hora, la mezcla cada 15 minutos.
- Centrifugar las células y descartar el sobrenadante.
- Lave con el medio dos veces. Los restos celulares se adhieren a la parte de los tubos de poliestireno. Las células muertas y los desechos pueden ser eliminados mediante un filtro de celular o por centrifugación en gradiente de densidad.
- Comprobar la pureza de la célula mediante la comparación de la población celular de interés antes y después de agotamiento. La citometría de flujo e inmunohistoquímica son dos buenos métodos para determinar la pureza de la célula.
Resultados representante
Cuando se utiliza un mAb que es muy eficaz en la activación del complemento, la depleción de células después de una ronda es mayor que el 95%. Esto se muestra en la Figura 1 donde comenzamos con esplenocitos de ratón compuesto de células T αβ 32,2% detectado por la expresión de TCRβ (eBioscience, San Diego, CA) por citometría de flujo. Hemos agotado las células T con un mAb específico para Thy1, una proteína expresada por todas las células T, pero no otros leucocitos. El anticuerpo que se utilizó Y-19 de una rata IgG2c 2. Siguiendo el procedimiento descrito, la población se redujo a TCRβ 1,56%, una reducción superior al 95%.
Figura 1. El agotamiento de las células del bazo thy1 + T por la activación del complemento. Esplenocitos totales de ratón se obtuvieron mediante la homogeneización del bazo y la lisis de glóbulos rojos. Anti-thy1 y complementar bebé conejos en concentraciones predeterminadas se han añadido a una suspensión de células individuales de los esplenocitos de tal manera que la concentración celular final fue 1 x 10 7 células / ml. Después de la incubación durante 1 hora a 37 ° C, las células fueron lavadas dos veces y evaluados por la exclusión de azul tripan para la viabilidad celular. La eficiencia de agotamiento se evaluó por citometría de flujo se compara el porcentaje de TCRβ + células antes de agotamiento (izquierda) y después de agotamiento (panel derecho). La barra horizontal indica tinción positiva y el número por encima de la barra es el porcentaje de positivos.
Discussion
La purificación de las poblaciones de células es un procedimiento común necesarios para el estudio de sus funciones. Aquí se describe un método rápido y eficaz de agotar las poblaciones de células con antígeno de los anticuerpos específicos y el agotamiento del complemento. El agotamiento de cualquier población de células se puede lograr si un anticuerpo complemento de activación está disponible para un marcador específico de linaje. Aquí hemos demostrado el agotamiento de las células T con un mAb específico para Thy1, una proteína expresada por prácticamente todas las poblaciones de células T. Hemos agotado más del 95% de las células T αβ y los esplenocitos restantes se incrementaron del 68% al 98%. Este nivel de pureza de las células es similar a otras estrategias de purificación y separación entre FACS cuentas magnéticas. El agotamiento del complemento es una técnica rápida que se pueden realizar en 1,5 horas una vez que la población de células de partida se obtiene. Otra ventaja del agotamiento del complemento es que cualquier laboratorio puede realizar la técnica, ya que no requieren equipos costosos y reactivos. Las únicas piezas principales del equipo requerido es un baño de agua y una centrífuga. Complemento de conejo se pueden comprar en una variedad de proveedores a un costo razonable (véase la tabla de reactivos) y muchos otros AcM se pueden comprar de ATTC y de origen local para controlar los costos. Por el contrario, FACS requiere un citómetro de flujo con una capacidad de clasificación de células que tendrá un costo de seis figuras y caras marcado con fluorescencia mAb. Separación de esferas magnéticas es de precio moderado, pero requiere la compra de un imán y las bolas magnéticas, que pueden ser costosos. Además, algunas estrategias de separación con bolas magnéticas también requieren la compra de las columnas.
El principal obstáculo para el uso del complemento para el agotamiento de las células es la disponibilidad de complementar la activación de AcMo con especificidad de antígeno requerida. Aunque los anticuerpos humanos, ratones y ratas tienen la capacidad de fijar el complemento, algunos isotipos son mejores que otros. A pesar de IgM de las tres especies es muy eficaz para la fijación de complemento de los isotipos IgG varían. Así, cada AcM primero debe ser probado en un estudio piloto para determinar su eficacia. Los anticuerpos que no son muy eficientes, dos rondas de agotamiento de complemento se puede realizar sin afectar la viabilidad de las poblaciones de células restantes. Como un ahorro de costes, los anticuerpos se debe ajustar para una eficacia óptima. Además, los anticuerpos utilizados no necesita ser purificado. Hibridoma sobrenadantes y el trabajo ascitis fluido con la misma eficacia, que es particularmente conveniente para los anticuerpos IgM, que son difíciles de purificar. Al igual que con los anticuerpos, es imprescindible que el complemento de ser valorados en un estudio piloto. Una alta concentración de demasiado resultará en la pérdida de la viabilidad de las poblaciones de células no específicas. También es importante que el tiempo de incubación no exceda de 60 minutos.
En nuestro protocolo, que co-incubar el anticuerpo y el complemento del conjunto. Sin embargo, las células pueden ser etiquetados con anticuerpos durante 15-30 minutos y se lava antes de la adición del complemento. Cuando se utiliza esta estrategia, asegúrese de llevar a cabo las incubaciones de anticuerpos en el hielo para evitar la pérdida del antígeno de células en la superficie celular, como ocurre con algunas de las proteínas mediante parches y la limitación o la internalización del receptor. Aunque altamente eficiente, el principal inconveniente para complementar el agotamiento, en comparación con otros métodos es que no se puede utilizar para la selección positiva. Por lo tanto, es difícil obtener las subpoblaciones de células. Por ejemplo, sería difícil de purificar las células B de zona marginal de células B folicular, que se podría realizar por FACS. En esta situación, la activación del complemento se podría utilizar la depleción de células T para reducir el número de células se van a ordenar. Esta estrategia reduciría el tiempo de clase, lo que ahorraría dinero y podría no ser tan duro en las células.
Desde la purificación de poblaciones celulares específicas es un requisito común una serie de estrategias se han desarrollado. Las principales ventajas de la estrategia de reducción del complemento son su accesibilidad, simplicidad técnica y ahorro de tiempo.
Acknowledgments
Me gustaría dar las gracias a Sreemanti Basu de proporcionar los datos de la Figura 1. Este trabajo fue apoyado en parte por subvención NIH AI069358 y la Fundación de Investigación BloodCenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | |
| Water bath | Various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
References
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
