补消耗的特定细胞群的枯竭

Summary

为了有效地研究其净化往往需要的人群的免疫细胞的功能。补枯竭是一个快速和廉价的技术，高纯度的免疫细胞群的隔离。

Abstract

免疫细胞群的净化，往往需要以研究其独特的功能。特别是，如实时PCR和基因芯片分析的分子的方法，需要高纯度的细胞群的隔离。常用的净化策略包括荧光激活细胞分选（FACS），磁珠分离和补充枯竭。补充枯竭的三个战略，提供了快速，价格低廉，对细胞和细胞产量高温和的优势。补体系统是由大量的血浆蛋白被激活时启动一种蛋白水解级联反应，最终在一个膜攻击复合物的形成，形成了一个在细胞表面，从而导致细胞死亡的孔隙

Protocol

A.兔补

1. 股票兔补充应在室温下解冻，然后分装成0.5和/或1毫升卷，并冻结在-20-80 ° C下长期贮存。
2. 每批补应滴定，以确定最佳的工作浓度。通常情况下，稀释的1:10-1:20是最佳选择。
3. 补兔补充并不总是presterilized在出售前，根据细胞的最终用途，应过滤消毒，分装时冻结或之前，除了细胞。

B.抗体选择

1. 并非所有的抗体是有效激活补体的抗体，从而必须先测试活动。
2. 小鼠和大鼠单抗是有效的补体活化。
3. IgM抗体通常是最有效的使用耳机，在补体诱导的细胞裂解。最好的补体激活的IgG亚型不同物种之间。
4. 每个抗体，应在10 ⁷细胞/ ml的细胞密度的最佳使用滴定。

C.基本协议

1. 细胞群开始调整至5 × 10 ⁷细胞/ ml的培养基中含有热灭活的FCS。最终的细胞量将两倍量。记住要保存一些细胞，可以量化的枯竭，使。
2. 每个抗体被添加到预定在适当的浓度或稀释的细胞悬液。混合反演细胞。
3. 计算所需的补充量。在室温下解冻的补充库存。如果是没有出息的补充，消毒，使用低蛋白结合注射器喷嘴过滤器。注射器，加几毫升的中型的补充除了之前和过滤直接进入管细胞和抗体。
4. 调整在管的最终体积，使细胞在1 ^× 10 7细胞/ ml。
5. 在37 ° C培养细胞一小时，每15分钟混合。
6. 离心机的细胞和上清液。
7. 中等洗两次。细胞碎片，将坚持以聚苯乙烯管方。使用细胞过滤器或密度梯度离心法，死细胞和碎片可以消除。
8. 检查细胞纯度比较耗尽之前和之后的细胞群体的利益。流式细胞仪和免疫组化确定细胞纯度的两个好方法。

代表性的成果

当使用一个回合后激活补体，细胞耗竭，是非常高效的单克隆抗体是大于95％。这是显示在图1中，我们开始与32.2％αβT细胞组成的小鼠脾细胞所表达的TCRβ流式细胞仪（eBioscience公司，加利福尼亚州圣迭戈）发现。我们耗尽使用mAb特异性为Thy1，所有的T细胞所表达的一种蛋白质，但没有其他白细胞T细胞。我们使用的抗体，Y - 19大鼠IgG2c ^2。下面的过程描述，TCRβ人口减少到1.56％，大于95％减少。

图1。 thy1耗尽⁺补体活化脾T细胞的小鼠脾细胞总数分别获得健脾和溶解红细胞的同质化。反thy1和婴儿在预定的浓度兔补充被添加到一个单细胞悬液，最终细胞浓度为1 × 10 ⁷细胞/ ml，脾等。潜伏期为1小时后在37 ° C时，细胞​​洗两次和细胞活力的台盼蓝排斥评估。枯竭的效率评估TCRβ+细胞的百分比流量比较之前耗尽（左图）和（右图）耗尽后流式细胞仪。单杠表示阳性，上述酒吧是积极的％。

Discussion

纯化的细胞群，是研究其职能所需的一个共同的过程。在这里，我们描述了一个快速和有效的方法消耗使用抗原特异性抗体和补体消耗的细胞群。的补充，激活抗体，如果是一个宗族的特定标记，可以实现任何细胞人口枯竭。在这里，我们展示了Thy1使用一个mAb特异性T细胞耗竭，基本上所有的T细胞群所表达的蛋白质。我们耗尽αβT细胞超过95％，余下的脾细胞从68％提高到98％。这种细胞纯度水平是相似的其它净化策略，包括流式细胞仪和磁珠分离。补枯竭是一种快速的技术，可在1.5小时内进行一次起始细胞群。补充枯竭的另一个优点是，任何实验室都可以执行的技术，因为它不需要昂贵的设备和试剂。唯一的主要件装备需要水浴和离心机。兔补充，可从不同厂商购买，以合理的成本（见试剂表）和许多单克隆抗体可以购买从美洲热带金枪鱼委员会和当地种植，以控制成本。相比之下，流式细胞仪需要与流式细胞仪检测细胞的分拣能力，将成本的六个数字和昂贵的荧光标记单克隆抗体。磁珠分离是价格适中，但需要购买一块磁铁和磁珠，这可能是昂贵的的。此外，一些磁珠分离战略，也需要购买的列。

补体细胞耗竭使用的主要绊脚石是所需的抗原特异性的单克隆抗体激活补体的可用性。虽然人类，大鼠和小鼠抗体所有有能力修正补充，一些亚型比别人做得更好。虽然从所有三个品种的IgM是高度有效地固定补充的IgG亚型有所不同。因此，每一个单克隆抗体，必须先在试点研究测试，以确定其有效性。对于不高效的抗体，，可以进行两轮补充枯竭，而不影响其余的细胞群的生存能力。由于节约了成本，抗体滴定为达到最佳效果。此外，使用的抗体并不需要得到净化。杂交瘤细胞培养上清和腹水的工作一样有效，这是特别方便的IgM抗体，这是很难净化。与抗体，它必须在一项试验研究滴定的补充。的浓度过高会导致非目标细胞群的生存能力损失。同样重要的是，孵化时间不超过60分钟。

在我们的协议，我们共同孵育抗体和补在一起。然而，细胞可以标记抗体为15-30分钟，冲前补此外。当使用此策略，确保执行冰，以防止损失的细胞在细胞表面的抗原抗体孵化，与某些蛋白质发生修补和上限或受体的内化。虽然高效，与其他方法相比，以补充枯竭的主要缺点是，它不能为正选择使用。因此，它是很难获得的细胞亚群。例如，将难以净化边缘区B细胞滤泡B细胞，最好是用流式细胞仪做。在这种情况下，激活补体可用于消耗性T细胞，以减少细胞被排序。该战略将减少排序的时间，这将节省的钱，将在不太苛刻的细胞。

由于特定的细胞群的净化，是一种常见的要求，已开发的战略。补充枯竭战略的主要优点是其经济承受能力，技术简单和节省时间。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-4 week baby rabbit complement	Pel-Freez Biologicals	31061-3
Water bath	Various	various	An incubator set at 37 °C can also be used.