Summary
Для эффективного исследования функции иммунной клеточной популяции их очистки часто требуется. Дополнение истощение быстрый и недорогой метод для изоляции иммунных клеточных популяций с высокой чистоты.
Abstract
Очистка иммунных клеточных популяций часто требуется для того, чтобы изучить их уникальные функции. В частности, молекулярные подходы, такие как ПЦР в реальном времени и микрочипов анализа требуют изоляции клеточных популяций с высокой чистоты. Обычно используемые стратегии очистки включают флуоресцентные активированный сортировки клеток (FACS), магнитно-бусинка разделения и дополнения истощения. Из трех стратегий, дополняют истощения предлагает преимущества быть быстрой, недорогой, нежный на клетки и высокий выход ячейки. Системы комплемента состоит из большого количества белков плазмы, что при активации инициировать каскад протеолитических кульминацией в формировании мембран-атаки комплекс, который формирует поры на поверхности клетки, что приводит к гибели клеток
Protocol
А. Кролик Дополнение
- Дополнять со кролика должно быть разморозить при комнатной температуре, а затем аликвоты в 0,5 и / или 1 мл объема и замораживают при -20-80 ° С в течение длительного хранения.
- Каждая партия дополнение следует титровать для определения оптимальной рабочей концентрации. Как правило, разбавления 1:10-1:20 является оптимальным.
- Кролик дополнением не всегда presterilized до продажи, в зависимости от конечного использования клеток, дополнения должны быть отфильтрованы стерилизовать при аликвоты и замороженных или перед добавлением к клеткам.
Б. Антитела выбора
- Не все антитела эффективны при активации комплемента, таким образом, антитела должны быть сначала проверены на активность.
- Обе мыши и крысы мАт эффективны при активации комплемента.
- IgM антитела, как правило, наиболее эффективные для использования в дополнение вызванного лизиса клеток следуют IgG. IgG изотипов лучше для активации комплемента отличаются между видами.
- Каждое антитело следует титровать для оптимального использования при плотности клеток 10 7 клеток / мл.
C. Основные протокола
- Отрегулируйте начиная клеточной популяции до 5 х 10 7 клеток / мл в среде, содержащей тепла инактивированной FCS. Конечный объем клетки будет в два раза, начиная объема. Не забудьте сохранить некоторые клетки так, что истощение поддается количественной оценке.
- Каждое антитело должна быть добавлена к суспензии клеток на должном заданной концентрации или разведения. Смешайте клетки хорошо инверсии.
- Рассчитать количество комплемента необходимо. Оттепель дополнением акции при комнатной температуре. Если дополнение не является стерильной, стерилизовать его, используя низкие связывания с белками фильтр наконечника шприца. Для шприц, добавьте несколько мл среды до того комплемента и фильтров непосредственно в пробирку, содержащую клеток и антител.
- Отрегулируйте конечного объема в трубку так, что клетки на 1 х 10 7 клеток / мл.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение одного часа, смешивая каждые 15 минут.
- Центрифуга клетки и отбросить супернатант.
- Промыть среду в два раза. Сотовые мусора будет придерживаться стороны полистирола труб. Мертвые клетки и мусор может быть устранено при использовании фильтра ячейку или центрифугирования в градиенте плотности.
- Проверьте чистоту ячейки путем сравнения клеточной популяции интереса до и после истощения. Проточной цитометрии и иммуногистохимии два хороших методов определения ячейки чистоты.
Представитель Результаты
При использовании МКА, что очень эффективно при активации дополнения, сотовые истощения после одного раунда больше чем 95%. Это показано на рисунке 1, где мы начали с мышью спленоцитов состоит из 32,2% клеток αβ T, которая была определена по выражению TCRβ (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния) с помощью проточной цитометрии. Мы обедненной T клеток с помощью МКА, специфичные для Thy1, белка, выраженные всеми Т-клетки, но не других лейкоцитов. Антител мы использовали, была Y-19 крыс IgG2c 2. После процедуры, описанной, TCRβ населения сократилась на 1,56%, более чем 95%-ное снижение.
Рисунок 1. Истощение thy1 + Т-клеток селезенки к активации комплемента. Всего спленоцитов мыши были получены путем гомогенизации селезенки и лизис РБК. Анти-thy1 и ребенка кролика дополнения в заранее определенных концентрациях были добавлены к суспензии отдельных клеток спленоцитов, что конечная концентрация ячейки 1 х 10 7 клеток / мл. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37 ° C, клетки промывают два раза и оценивается трипанового синего исключения для жизнеспособности клеток. Эффективность истощения оценивали с помощью проточной цитометрии сравнивая процент TCRβ + клеток до истощения (слева) и после истощения (правая панель). Горизонтальная полоса указывает на положительное окрашивание и выше номер бара процентов положительный.
Discussion
Очистка клеточных популяций распространенная процедура, необходимые для изучения их функций. Здесь мы опишем быстрый и эффективный метод истощения клеточных популяций использованием антиген-специфических антител и дополнения истощения. Истощение любой популяции клеток могут быть достигнуты, если комплемент-активации антител доступна для линии специфическим маркером. Здесь мы показали истощение Т клеток с помощью МКА, специфичные для Thy1, белок, выраженных по существу, все Т клеточные популяции. Мы обедненного более 95% αβ Т-клеток и оставшиеся спленоцитов были увеличены с 68% до 98%. Этот уровень клеточного чистоты похож на другие стратегии, в том числе очистка FACS и магнитные бусины разделения. Дополнение истощение быстрый метод, который может быть выполнен в 1,5 часов после начала клеточной популяции получается. Еще одно преимущество дополнением истощения в том, что каждая лаборатория может выполнять технику, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Только основные части оборудования, необходимого являются водяной бане и центрифуги. Кролик дополнение можно приобрести у различных производителей по разумным ценам (см. таблицу реагентов) и многие мАт можно приобрести у ATTC и выращенного для управления затратами. В отличие от этого, FACS требует потока цитометр с соты сортировки, которая будет стоить в шесть цифр и дорогих флуоресцентно меткой МАБ. Магнитный шарик разделение умеренным ценам, но требует покупки магнита и магнитных бус, который может быть дорогостоящим. Кроме того, некоторые магнитные бусины стратегии разделения также требуют покупки колонок.
Основным камнем преткновения для использования дополнением для сотовых истощения является наличие комплемента активации МАБ с антигенной специфичности требуется. Хотя человека, мыши и крысы антител у всех есть возможность исправить дополнением, некоторые изотипов лучше, чем другие. Хотя IgM из всех трех видов является весьма эффективным при фиксации дополнением IgG изотипов меняться. Таким образом, каждый МКА должны быть сначала протестированы в рамках пилотного исследования с целью определения его эффективности. Для антитела, которые не являются высокоэффективными, два раунда дополнением истощения могут быть выполнены без ущерба для жизнеспособности оставшихся клеточных популяций. Как экономии средств, антитела следует титровать для оптимальной эффективности. Кроме того, антитела использоваться не должны быть очищены. Гибридома супернатанты и асцит жидкости работать так же эффективно, что особенно удобно для IgM антитела, которые трудно очистить. Как и антитела, крайне важно, чтобы дополнять титровать в экспериментальном исследовании. Слишком высокой концентрации может привести к потере жизнеспособности нецелевых клеточных популяций. Также важным является то, что инкубационный период не превышает 60 минут.
В нашем протокол, мы сотрудничаем инкубировать антител и дополнять друг с другом. Тем не менее, клетки могут быть помечены с антителами в течение 15-30 минут и промывают до того комплемента. При использовании этой стратегии, убедитесь, что для выполнения антител инкубации на льду, чтобы предотвратить потерю ячейки антигеном на поверхности клетки, как это происходит с некоторыми белков исправлений и укупорки или интернализация рецепторов. Хотя высокоэффективным, главный недостаток в дополнение к истощению, по сравнению с другими методами является то, что она не может быть использована для положительного отбора. Таким образом, трудно получить субпопуляций клеток. Например, было бы трудно очистить маргинальной зоне В-клеток фолликулярного В-клеток, которые лучше всего сделать, FACS. В этой ситуации, активации комплемента могут быть использованы для Т-клеток, разрушающих уменьшить количество клеток быть отсортированы. Эта стратегия позволит снизить рода времени, что позволит сэкономить деньги и будут менее суровыми клеток.
После очистки конкретных клеточных популяций является общим требованием ряд стратегий были разработаны. Основные преимущества стратегии истощения дополнением являются его доступность, техническая простота и экономия времени.
Acknowledgments
Я хотел бы поблагодарить Sreemanti Басу за предоставление данных для рисунке 1. Эта работа была выполнена при частичной поддержке гранта NIH AI069358 и Фонда BloodCenter исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | |
| Water bath | Various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
References
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
