Isolering av Mouse bukhålan celler

Summary

Bukhålan hos däggdjur innehåller olika immunceller populationer avgörande för medfödda immunsvar. En effektiv isolering metod krävs för biokemiska och funktionella analyser av dessa celler. Här kan vi ge en heltäckande metod för isolering av bukhålan celler i musen.

Abstract

I bukhålan är ett membranbundna och vätskefyllda bukhålan hos däggdjur, som innehåller lever, mjälte, de flesta av mag-tarmkanalen och andra inälvor. Det hamnar en rad av immunceller, inklusive makrofager, B-celler och T-celler. Förekomsten av ett stort antal naiva makrofager i bukhålan gör det till en önskad plats för insamling av naiva makrofager vävnad bosatt (1). Bukhålan är också viktigt att studera B-celler på grund av förekomsten av en unik bukhålan hemmahörande B-cells delmängd kallas B1 celler i tillägg till konventionell B2 celler. B1 celler är indelade i B1a och B1b celler, som kan skiljas av ytan uttryck för CD11b och CD5. B1 celler är en viktig källa till naturlig IgM ger tidigt skydd mot en rad olika patogener (2-4). Dessa celler är autoreaktiva i naturen (5), men hur de styrs för att förhindra autoimmunitet är fortfarande inte förstår helt. Tvärtom, CD5

Protocol

1. Innan processen startar, följande punkter måste vara att samlas in och bearbetade:
   • Ice
   • 5ml spruta med 27g nål
   • 5ml spruta med 25g nål
   • Frigolit block och stift för montering musen
   • Fack som Monteringskloss kan placeras
   • Sax och pincett
   • Insamling rör
   • 70% etanol
   • PBS med 3% fetalt kalvserum (FCS) (Pre kylda och förvaras på is)
2. Euthanize musen, spraya den med 70% etanol och montera den på frigolit block på ryggen.
3. Med hjälp av en sax och pincett skär den yttre huden på bukhinnan och försiktigt dra tillbaka den för att exponera den inre huden slemhinnan i bukhålan.
4. Injicera 5 ml iskall PBS (med 3% FCS) in i bukhålan med hjälp av en 27g nål. Tryck in nålen långsamt i bukhinnan försiktigt så att inte punktera några organ.
5. Efter injektionen, massera försiktigt bukhinnan att få bort alla bifogade celler i PBS-lösning.
6. Sätt i en 25 g nål, fasning upp, fäst vid en 5 ml spruta i bukhinnan och samla vätska medan du flyttar nålspetsen försiktigt för att undvika igensättning av fettvävnad eller andra organ. Samla så mycket vätska som möjligt och sätta in de insamlade cellsuspensionen i tuber kvar på isen efter att ta bort nålen från sprutan.
   Tillval: Upprepa steg 4-6
7. Gör ett snitt i den inre huden på bukhinnan och medan du håller upp huden med en pincett använda en plast pasteurpipett att samla in de resterande vätska från hålighet.
8. Om i steg 6 eller 7 synliga blodsmitta upptäcks då det förorenade provet ska kasseras.
9. Snurra in cellsuspension vid 1500 rpm i 8 minuter, kassera supernatanten och suspendera cellerna i önskat media eller PBS för räkning.

Alternativa protokollet för att få thioglycollate utlöste makrofager:

Denna metod används för att få en högre avkastning av makrofager.

1. Injicera 5 ml 3% (w / v) Brewer thioglycollate medelstora (7) in i bukhålan på varje mus.
2. Vänta i 3-5 dagar, och går vidare till steg 1 ovan för insamling av cellerna.

Jämfört med nonelicited tillvägagångssätt, kan ungefär 10 gånger mer makrofager samlas in. Den enda oro är att makrofager erhålls genom detta förfarande skiljer sig i några av deras fysiologiska egenskaper.

Representativa resultat:

Ur ett unmanipulated musen kan 5-10.000.000 bukhålan celler fås med en bra isolering protokoll. Bland alla levande celler, 50-60% är B-celler, ~ 30% makrofager och 5-10% är T-celler (Fig. 1).

Figur 1. Fenotyp av celler isolerade från bukhålan. Följde isolering av bukhålan celler de färgats med anti-mus TCRβ-FITC, B220-PE-Texas röd, CD11b-Pacific Blue, CD23-PE-Cy7 och CD5-APC. Representant flödescytometrisk tomter visa procentandelar av B-och T-celler (en), makrofager (b), B1 och B2 celler (c) och B1a och B1b celler (d).

Discussion

Isolering av bukhålan celler är en viktig teknik för studier av olika immunceller, främst makrofager och specifika B delmängder cell. Även om detta är en enkel process, det finns vissa kritiska inblandade steg. Förekomst av kontaminerande blod i de insamlade prov bör undvikas för att få en ren peritoneal befolkning hålighet cell. Dödshjälp av halsdislokation bör göras noggrant för att undvika blodsmitta i bukhålan. Alternativt CO ₂ kan användas. Dessutom bör under förfarandet ordentlig försiktighet iakttas för att undvika att punktera blåsan eller andra organ i bukhålan. Återställa det mesta av den injicerade vätskan är också viktigt att cellen avkastning.

Detta förfarande används flitigt för att studera makrofager biologi sedan måttliga antal invånare, kan ostimulerade makrofager lätt erhållas från bukhålan, i motsats till den mödosamma uppgiften att skilja myeloida stamceller till mogna makrofager in vitro, med hjälp av makrofag kolonistimulerande faktor (8 , 9). Den makrofager avkastningen från bukhålan kan förbättras med hjälp av thioglycollate framtagning metod, även thioglycollate användning kan förändra fysiologiska egenskaper makrofager (7).

B-celler är en viktig del av vårt immunsystem spelar avgörande roller i både medfödd och adaptiv immunitet. Mellan olika subpopulationer B-celler, B1 celler utgör en unik delmängd av B-celler som deltar i medfödd immunitet, autoimmunitet och immun reglering. B1 celler är främst belägna i bukhålan och är själv fylla på. De är en av de främsta producenterna av naturlig IgM som ger första raden av skydd mot ett flertal virus och bakterier (10-12). B1 celler är också en viktig källa för IL-10 (6), vilket är en viktig cytokin involverade i immunförsvaret reglering. Trots att flera studier har bedrivits med B1 celler, fortfarande finns det utrymme för ytterligare utvärdering av deras kontrasterande funktioner, speciellt deras reglerande roll. Bukhålan cell isolering metod ger en unik möjlighet att studera funktionen hos B1 celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thioglycollate Medium, Brewer Modified	BD Biosciences	211716