Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Summary

Controle e análise de circuitos neurais

Abstract

Nossa compreensão dos circuitos neurais - como eles mediam os cálculos que a sensação subserve, pensamento, emoção e ação, e como eles estão corrompidos em distúrbios neurológicos e psiquiátricos - seria muito facilitado por uma tecnologia para rapidamente genes alvo a 3 complexos - dimensional circuitos neurais, permitindo a criação rápida de "nível de circuito transgênicos." Recentemente, desenvolvemos métodos em que os vírus de codificação para proteínas sensíveis à luz, pode sensibilizar os tipos de células específicas para milissegundo-calendário de ativação e silenciamento no cérebro intacto. Nós aqui apresentar o projeto ea implementação de um conjunto injector capaz de entregar vírus (ou outros fluidos) para dezenas de pontos definidos dentro da estrutura 3-dimensional do cérebro (

Protocol

1. Construção Grampo estereotáxica

1. A braçadeira estereotáxica é utilizada para a fixação da matriz para o injector stereotax, de modo que os injetores são paralelas ao braço estereotáxico.
2. Cada laboratório precisa de apenas uma pinça, a menos que se prevê que mais de uma cirurgia pode ocorrer simultaneamente. Neste caso, faça o mesmo número que o número máximo previsto de cirurgias simultâneas. Também pode ser aconselhável fazer um extra, em caso de dano ao primeiro.
3. Para fazer a braçadeira estereotáxica, em primeiro lugar, a 1,5 mm de diâmetro exterior (OD) de aço cânula é cortada a 2 polegadas de comprimento, e uma das extremidades é Dremeled baixo até plana.
4. Em seguida, um pedaço pequeno (aproximadamente 0,5 x 0,5 cm) é cortado do PCB proto-board, para ser usado como um espaçador.
5. Usando um cortador de laser para garantir que todos os cortes feitos são perpendiculares à superfície do material, dois retângulos idênticos (1 / 2 "x 3 / 8") são cortadas a partir de 08/01 folhas "de acrílico, cada retângulo, tendo dois furos circulares em cantos opostos do retângulo. O primeiro buraco tem diâmetro 1.5mm, e é grande o suficiente para segurar a cânula metálica firmemente. O segundo buraco tem diâmetro de 1 / 16 "(Figura 1C).
6. A cânula de metal é inserido no furo de 1,5 mm de um retângulo, então através do furo de 1,5 mm do segundo. A extremidade inferior da cânula está alinhado com a face inferior do retângulo de fundo, formando o formato de um taco de hóquei.
7. Mantendo o espaçador são mantidas em segredo entre os dois retângulos, esta estrutura é cimentada juntos usando cola quente em torno dos furos cânula e 1.5mm, com cuidado para evitar a colagem o espaçador ao retângulos. Massa de modelar pode ser útil para manter as coisas em conjunto durante esse processo.
8. Depois que a cola secar, um parafuso 1-72 é inserido dentro do buraco 1 / 16 do lado superior dos retângulos. Em seguida, uma porca 1-72 é parafusado na extremidade do parafuso 1-72, e apertados. O parafuso e porca servem para manter o grampo juntos.
9. Para anexar a porca sextavada para a face inferior do retângulo inferior, pequenas quantidades de 5 minutos de epóxi são descartados em torno da borda da porca, sem permitir que o epóxi para entrar no tópicos da porca ou parafuso. Qualquer massa de modelar é removida, e confirma-se que o espaçador pode ser realizada firmemente no lugar de apertar o parafuso.

2. A preparação do sistema para a matriz injector personalizado: Hamilton bomba e stereotax

1. O sistema de matriz de injetora pode ser personalizado para praticamente qualquer conjunto de coordenadas no cérebro.
2. O primeiro usuário localiza coordenadas dos locais de injeção desejada em um mouse (ou outras espécies) atlas do cérebro, a conversão para as coordenadas adequada utilizada pelo stereotax (aqui, X, Y, Z e coordenadas). O número de locais de injecção (três nas figuras 1A e 1B) serão seguidamente chamado k.
3. k número de 10 seringas Hamilton mL são colocados em uma bomba de seringa / retirada como este aparato de Harvard.
4. Em seguida, três metros de comprimento pedaços de tubos de polietileno são firmemente conectado à agulha de cada seringa Hamilton.
5. Para cada pedaço de tubo de polietileno, uma F-252 manga tubulação de Upchurch Scientific é deslizou sobre a extremidade aberta e conectada a um adaptador de tubos P-627 usando a porca incluído e ponteira, também da Upchurch Científico.

3. Construção da matriz Injector Customized

1. Cada matriz injector é personalizado para o conjunto de coordenadas que o usuário escolhe. No entanto, para conjuntos de coordenadas que diferem apenas por uma tradução e / ou de rotação, a matriz injector mesmo pode ser usado.
2. Considerando apenas a relação X e Y coordenadas dos locais de injecção, os buracos são perfurados em k um PCB proto-board de espessura 1 / 32 ", com o mesmo espaçamento relativo. Estes buracos são perfurados utilizando um mini-mill MODELA e 0,011" diâmetro da broca da McMaster-Carr. Tenha certeza de usar um ritmo lento de perfuração (Z-speed) para evitar a quebra ou desgaste da broca. Antes de remover a placa da fábrica, um retângulo é perfurado em torno dos furos pequenos, usando um pouco maior broca de diâmetro 1 / 32 ", para evitar desgaste o menor código para o mini-mill podem ser gerados facilmente usando MATLAB;. Amostra código é fornecido nos seguintes arquivos.
   1. generate.m - código MATLAB para gerar o código MODELA de coordenadas desejado
   2. holes_ex.rml - MODELA código para perfuração padrão de toque (oito furos) em Proto-board
   3. outline_ex.rml - MODELA código para perfuração retângulo em torno de buracos
3. 245 mM mM OD/100 diâmetro interno (ID) tubo capilar de sílica fundida, disponível a partir Polymicro Technologies, é cortado em k número de 3 peças polegadas. Estes compreendem os injetores individuais. Uma peça descartável de tubo capilar é picado por meiocada um dos buracos, para limpar os restos sem entupir os injectores real. Os injectores são, então, inserido no meio em cada buraco, para que eles fiquem presos e paralelos um ao outro. Os injetores são epoxied à placa, formando a estrutura da matriz injector. Tudo o que resta é para aparar os injetores para o comprimento correto.
4. A matriz injector é anexado ao grampo estereotáxica, colocando um canto do proto-board entre os retângulos de acrílico, e em seguida apertando o parafuso da braçadeira estereotáxica. Em seguida, a cânula de metal do grampo está ligado à stereotax, utilizando o mecanismo de fixação do stereotax.
5. Todas as seguintes é feito sob um microscópio. Para um dos injectores exterior (isto é, aquele que pode ser abordado a partir do lado com uma borda em linha reta, sem esbarrar em nenhuma das outras injetores), a ponta se estendem para além do fundo do proto-board é cortado com tesoura. Cortical para injectáveis, é necessário ter o injetor estendendo aproximadamente 5mm além da superfície da proto-board. Para injecções profundas, este número pode ser aumentado pelo aumento correspondente em profundidade. A dica é achatado, com uma ferramenta Dremel. Dicas Injector também pode ser chão em um ângulo como uma precaução adicional contra entupimento, se a precisão em profundidade é menos importante.
6. Em seguida, um ponto de referência estável é escolhido dentro do alcance do braço estereotáxico, ea matriz injector é movida de modo que a ponta achatada da injector exterior, é neste ponto de referência.
7. Um injector segundo é escolhido, juntamente com suas coordenadas correspondentes. Considerado é a diferença relativa de altura (direção z) entre as coordenadas primeiro e segundo injector. A matriz injector é movido ao longo do eixo Z por essa distância relativa. O injetor segundo é aparado e Dremeled para o comprimento correto, de modo que a ponta do injector é agora segundo plano e na altura do ponto de referência. A matriz injector pode ser movido em direções X e Y para facilitar a comparação da ponta do injector com o ponto de referência.
8. Este processo de corte é repetido para os injectores restantes.

4. Montagem de todo o sistema

1. A braçadeira estereotáxica e matriz injector personalizado, ambos já construídas, são necessários para esta parte.
2. O back-end de cada injetor (a fim de que não tenha sido aparadas) é inserido em um azul F-240 tubos de manga e, usando uma P-235 porca e P-200 ponteira da Upchurch Científico, está ligado ao adaptador de rosca já está conectado para a bomba de Hamilton por tubos de polietileno. Instruções do fabricante pode ser consultado para mais detalhes.
3. Usando uma agulha de calibre 27, óleo de silicone é injetado na parte de trás do seringas Hamilton, para que todo o sistema é preenchido da seringa Hamilton até a ponta do injector, sem bolhas de ar em tudo.
4. Como as seringas Hamilton são re-colocados na bomba de Hamilton, o maior volume possível de óleo de silicone é mantida nas seringas.
5. Se o experimento requer seringas mais do que a bomba foi projetada para (dois neste caso), as seringas podem ser espaçadas com pequenos pedaços de plástico (por exemplo, tampas de agulha) para mantê-los paralelos um ao outro, e para garantir que todas as peças são empurrada pela bomba na mesma medida. Ou, um multi-rack kit de atualização pode ser comprado de Harvard Apparatus para armazenar até 10 seringas de uma vez.

5. Injecções / cirurgia

1. O processo de injeção com um injector paralelo é muito semelhante ao de injetar com uma pipeta único.
2. É imprescindível a utilização de recarga lenta / infundir taxas ao longo deste processo, porque o bombeamento rápido pode colocar pressão sobre a articulação entre a tubulação de grande e pequeno porte. Recomenda taxa max: 2 l / min para o carregamento de vírus, e 0,1 mL / min de infusão de vírus.
3. Um rato anestesiado é colocado no stereotax, e continua a ser anestesiados durante todo o experimento.
4. Prepare o mouse quando necessário. Por exemplo, com um bisturi, um único corte é feito abaixo da linha média da pele, de entre os olhos para entre as orelhas. A pele é puxada para trás para expor o crânio e da fáscia é removido. A pipeta de vidro puxado é anexado ao stereotax. As posições das barras de ouvido são ajustados até bregma e lambda são alinhados com a mesma altura, e para que a linha de conexão deles é paralela ao eixo Y do stereotax. Os eixos da stereotax são orientadas de acordo com o sistema de coordenadas no qual as coordenadas de injeção foram calculados. O estereotáxica é zerado com a ponta da pipeta de vidro na bregma, e então a dica é posicionado ligeiramente acima do crânio, o X e Y coordenadas de um dos locais de injecção.
5. Usando uma broca de dentista, o crânio abaixo da ponta é cuidadosamente pared afastado até que resta uma camada extremamente fina de osso. A pipeta de vidro pode ser menored e levantou para verificar que o furo está sendo perfurado está centrada na posição correta. Usando uma agulha de calibre 30, um pequeno pedaço da camada é delicadamente apanhados, na X-Y-e corrigir as coordenadas, de modo que a dura-máter está exposto. Este buraco deve ser grande o suficiente para caber um dos injetores (0,25 mm de largura). Ver Figura 1D para diagrama. Desta forma, pequeno, 0,25 milímetros de largura furos são feitos no crânio, no X e Y coordenadas correspondentes a cada local da injeção.
6. A pipeta de vidro é descartada em um recipiente, ea matriz injector personalizado é anexado ao stereotax usando a braçadeira estereotáxica.
7. , A fim de definir corretamente o ângulo da matriz injetor, dois injetores exterior são escolhidos para serem calibrados para um determinado ponto de referência, como segue. Depois de um dos injectores é compensada com o ponto de referência, considere o X-Y-e relativa distâncias entre os locais de injecção injector em relação a este e outro. Os eixos da stereotax são ajustados de modo que a matriz injector inteiro é movido na X e Y direções por estas distâncias relativas. Se o segundo injector não é agora alinhada com o ponto de referência, a cânula de metal é solto e rodado. Este processo é repetido iterativamente até que a matriz injector está inclinado corretamente.
8. Antes de preencher os injectores com o vírus, os injetores são preenchidos com óleo de silicone até que as seringas estão no ponto 2 l (ou superior). Isso proporciona uma zona tampão, de modo que as bolhas de ar ou entupimento na ponta pode ser facilmente removido, empurrando o óleo para a frente usando a bomba Hamilton, sem ter de reabastecer o sistema com óleo de silicone na parte de trás das seringas, como descrever anteriormente.
9. Um pedaço estéril de Parafilm é colocado sobre o crânio, e os injetores são levemente abaixada na Parafilm. Para coordenadas com profundidades variando muito, uma parte-custom moído (por exemplo, um objeto em forma de escada) poderia facilitar o carregamento.
10. As peças a seguir assumem que 1 ml de vírus está a ser carregado em cada local (as seguintes quantidades devem ser reduzidas se quantidades menores são desejados). , A fim de garantir que> mL 1 do vírus é injetado em cada local, 1,5 mL de vírus é pipetado para o Parafilm ou escada na ponta de cada injector.
11. Com a taxa de recarga da bomba Hamilton definido para 1 ml / min, 1,2 mL do vírus é recarregado em cada injector.
12. A ponta do mais longo injetor é zerado no bregma, em seguida, a matriz injector é deslocado para o X e Y coordenadas desse injector. Se a obstrução é um problema, dizer se muitos alvos profundos estão envolvidos: mesmo antes de inserir o injector dicas para o cérebro, às vezes é aconselhável iniciar a infusão da bomba, até que o vírus pode ser visto saindo de todas as dicas do injetor. Isso remove as bolhas de ar nas pontas injector, e também garante que não há entupimento. No caso de entupimento, a bomba de Hamilton está definido para infundir um breve pulso a uma velocidade superior de 2 mL / min, para limpar suavemente entupimento.
13. A matriz injector é então abaixada, através dos furos pequenos feitos com as agulhas de calibre 30, para a correta Z profundidade.
14. 1 ml de vírus é injetado através de cada injector, a 0,1 mL / min.
15. As injecções são deixados sozinhos por 30 minutos.
16. Após a matriz injector está lentamente extraído do cérebro, a bomba de Hamilton está definido para infundir na mesma taxa de 0,1 mL / min, a fim de verificar se há entupimento em cada injector.
17. Em seguida, os injetores são limpos por recarga e infundindo 1,5 mL de etanol a 2 l / min.
18. Finalmente, os injetores são recarregados com óleo de silicone para manter a zona tampão 2 mL em cada seringa Hamilton.
19. Todos os equipamentos devem ser esterilizados antes e após o procedimento, de acordo com a biossegurança da sua instituição e protocolos de uso de animais.

6. Resultados representante

A matriz injector paralelo acelera uma cirurgia aproximadamente por um factor igual ao número de injetores, sem contar a instalação e tempo de recuperação, apesar de tempos individuais dependerá da habilidade do praticante. Para uma injecção microlitro 1, que normalmente viu a expressão lentivírus em uma esfera de aproximadamente 1 milímetro de diâmetro (Fig. 1E). A precisão da injeção era tal que a variabilidade no posicionamento da ponta, do julgamento a julgamento, foi cerca de 45 microns (desvio padrão da distância da posição da ponta para a posição de ponta pretendido).

Figura 1. Design, implementação e uso de uma variedade de vírus paralelo injector. Um esquema, do sistema paralelo conjunto injector, mostrando uma configuração injector triplo, para três injeções simultâneas. B, fotografia de uma matriz injector triplo paralelo como diagramado em A . braçadeira estereotáxica, mostrado em linhas gerais a partir do topo D, ilustração da técnica de eficiente, minimizando o dano, a abertura de buracos no crânio para injector inserção no cérebro:. com uma broca de dentista, diluir o crânio para baixo a espessura ~ 50 microns, em seguida, use a ponta de uma agulha fina para abrir uma pequena craniotomia. E imagem, mostrando fluorescência channelrodopsina-2 (ChR2)-GFP-rotulados células em três regiões do mouse cortical, como alvo de matriz injector triple mostrado na B.

Discussion

Nos últimos anos, uma série de organismos geneticamente codificados sensitizers óptica permitiram neurônios para ser ativado e silenciadas in vivo de uma forma temporalmente preciso, em resposta a pulsos breves de luz (por exemplo, ^{1,4,5,6,7,8 , 11).} Um método de chave com a qual os neurônios foram sensibilizados para a luz do cérebro de mamíferos, é através de vírus como o lentivírus e vírus adeno-associado (AAV), que pode entregar genes que codificam para opsins aos cérebros de animais, de camundongos a macacos, em um forma segura e duradoura (por exemplo, ^2,9,10). Vírus permitem que o tempo de resposta mais rápido do que os transgênicos, especialmente para organismos que não são organismos modelo genético, como ratos e macacos, e para opsins pode permitir níveis de expressão elevada que pode não ser possível em cenários de transgênicos. Aqui demonstramos um conjunto injector paralelo capaz de criar, em uma escala de tempo rápida, "no nível do circuito transgênicos", permitindo que toda a estrutura 3-dimensional do cérebro para ser virally alvo de um gene, em uma única etapa cirúrgica. A matriz injector é composto por uma ou mais bombas de deslocamento que cada unidade de um conjunto de seringas, cada qual alimenta um sílica fundida poliimida / capilar através de um conector de alta pressão tolerante. Os capilares são dimensionados, e depois inserido, locais desejados especificado por custom-moagem de uma placa de posicionamento estereotáxico, permitindo assim que os vírus ou outros reagentes para ser entregue ao conjunto desejado de regiões do cérebro. Para utilizar o dispositivo, o primeiro cirurgião enche o subsistema fluídico inteiramente com óleo, aterros os capilares com o vírus, insere o dispositivo no cérebro, e infunde reagentes lentamente (<0,1 mL / min).

Esta tecnologia permitirá uma ampla variedade de novos tipos de experimentos, tais como milissegundo-calendário de encerramento do complexamente em forma de estruturas (tais como o hipocampo) em momentos precisos durante o comportamento, a inativação temporalmente precisa de estruturas bilaterais que possam atuar de forma redundante (como a amígdala esquerda e direita), e da perturbação de múltiplas regiões cerebrais distintas (por exemplo, dirigindo duas regiões ligadas fora de fase para estudar como região-cross sincronia depende de atividade em cada região, ou estimulando as entradas para uma região ao mesmo tempo silencia um subconjunto de as metas a fim de compreender qual dos diversos alvos são críticos para mediar os efeitos dessas entradas). Para cérebros grandes como os do primata, em que demonstraram recentemente óptico tipo de célula-específicos de ativação neural ^3, perturbando a atividade em uma área comportamentalmente relevante pode exigir rotulagem viral de grandes estruturas complexas. Notamos que arrays paralelos injector pode ser usada para injetar quase toda a carga - drogas, neuromoduladores, neurotransmissores, ou mesmo células - no complexo 3-D padrões no cérebro, de uma forma temporalmente preciso. Finalmente, do ponto de vista de translação, é possível que rápida, a terapia gênica-paciente personalizados ou dispositivos a entrega da droga pode ser rapidamente personalizado projetado e fabricado para coincidir com geometrias cérebro individual, apoiando novos tratamentos para uma variedade de patologias, potencialmente através do uso de óptico moléculas de controle.

As matrizes injector são projetados para ser mais preciso, tanto espacialmente e volumetricamente. No X-e Y-direções, isso é feito furos colocados com muita precisão usando um barato mini-mill, com os buracos grandes o suficiente para caber os injectores, de modo que injetores são mantidos paralelos um ao outro, e de forma precisa localização. Na direção Z, os injetores são aparados usando um aparelho estereotáxico, permitindo um nível de precisão equivalente ao da cirurgia estereotáxica em si. A precisão volumétrica surge a partir da precisão da bomba de Hamilton, bem como a quase zero mortos-volume conectores, adaptado de um método de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) de campo. Os injetores são feitos de tubo de capilar de sílica fundida, que é forte e rígida o suficiente para que ele mantém forma precisa e espaçamento sob pressão, sem a espessura da parede maior de alternativas, tais como cânulas de aço. Pequenas modificações podem facilmente ser feitos para se adaptar a matriz injector paralelo a uma variedade de experimentos. Por exemplo, se um menor volume de vírus ou o espaçamento mais fino é necessário, menores tubo capilar pode ser empregado, juntamente com uma broca correspondente menores. Futuros dispositivos podem utilizar canais microfluídicos e bombas, para aumentar o número de injetores paralelo, para minimizar o tamanho (talvez permitam que esses dispositivos para ser montado sobre as cabeças dos animais que se deslocam livremente).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dremel Tool	Tool	Dremel	3956-02
Laser Cutter	Tool	Universal Laser Systems	VLS2.30
Hot glue gun	Tool	Stanley Bostitch	GR20
Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)	Tool	Harvard Apparatus	702001
10 μl Hamilton syringes	Tool	Hamilton Co	701N	Need one per injection site
Mouse stereotax	Tool	Stoelting Co.	51725D
Modela mini-mill	Tool	Roland	MDX-15
0.011" diameter drill bit for mini mill	Tool	McMaster-Carr	8915A12
1/32" diameter drill bit For mini-mill	Tool	McMaster-Carr	8848A35
High speed dental drill	Tool	Lynx	333
Dental drill accessories	Tool	Pearson Assessments	F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38
1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula	Material	Small Parts, Inc.	HTX-15R
1-72 binding slotted machine screw	Material	Small Parts, Inc.	MX-0172B
1-72 hex nut	Material	Small Parts, Inc.	HNX-0172
PCB proto-board, 1/32" thick	Material	Digi-Key	PC57-T-ND
Acrylic Sheet, 1/8" thick	Material	McMaster-Carr	8560K239
HPLC connectors	Material	Upchurch Scientific	F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an ‘x’ to the end of the part number)	Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused
Fused silica capillary tubing, OD: 245 μm, ID: 100 μm	Material	Polymicro Technologies	2000022-10M
5-minute general purpose epoxy	Material	Permatex	84101	5-minute general purpose epoxy
Polyethylene tubing .066 x .095 inch	Material	VWR international	63018-827