Summary
جرحشاعثزرحشرتاد مضان التصوير المقطعي يعمل خارج حدود اختراق الأنسجة sectioning المجهري مضان. وتستند هذه التقنية على التعددية إسقاط الإضاءة والنقل وصفا الفوتون. علينا أن نظهر في الجسم الحي ، كامل الجسم التصور 3D من التشكل من GFP - معربا عن أقراص تخيلي في الجناح
Abstract
تصور النامية تشكيل هيئة وكذلك progession والعلاج من المرض بشكل كبير في كثير من الأحيان يعتمد على القدرة على استجواب بصريا التغيرات الجزيئية والوظيفية في الكائنات الحية سليمة. معظم طرق التصوير الضوئي الموجودة ليست كافية للتصوير في الأبعاد التي تقع بين حدود تغلغل المجهر الضوئي الحديثة (0.5 - 1MM) والحدود التي يفرضها الانتشار من الفحص العياني البصرية (> 1cm) [1]. وهكذا ، كثير من الكائنات الحية نموذجا هاما ، مثل الحشرات والأجنة الحيوانية أو الأطراف الحيوانات الصغيرة ، وتظل غير قابلة للوصول لداخل الجسم الحي التصوير الضوئي.
على الرغم من أن هناك اهتماما متزايدا نحو تطوير نانومتر القرار أساليب التصوير الضوئي ، لم تكن هناك الكثير من الجهود الناجحة في تحسين عمق الاختراق التصوير. القدرة على أداء في الجسم الحي ، والتصوير المجهري وراء الحدود هو في الواقع اجتمع مع الصعوبات المرتبطة نثر فوتون موجودة في الأنسجة. الجهود المبذولة مؤخرا لأجنة الصورة بأكملها على سبيل المثال [2،3] خاصة تتطلب المعالجة الكيميائية للعينة ، لحملهم على مغادرة نثر ، وهو الإجراء الذي يجعلها مناسبة فقط لتصوير ما بعد الوفاة. لكن هذه الأساليب دليل على الحاجة إلى عينات أكبر من تلك التصوير يسمح عادة عن طريق الفحص المجهري أو ثنائي الفوتون مبائر ، ولا سيما في البيولوجيا التطورية ، واكتشاف المخدرات.
لقد قمنا بتطوير تقنية التصوير الضوئي الجديد المسمى جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار التصوير المقطعي [4] ، والتي مناسبة لتصوير داخل الجسم الحي غير الغازية في أبعاد 1MM - 5mm. القرار التبادلات طريقة لعمق الاختراق ، ولكن عروض لم يسبق لها مثيل الأداء والتصوير تصوير الشعاعي الطبقي تم تطويره لإضافة الوقت وبعدا جديدا في الملاحظات البيولوجيا التطورية (وربما غيرها من مجالات البحوث البيولوجية) عن طريق نقل القدرة على صورة تطور مضان. الموسومة الردود على مر الزمن. على هذا النحو فإنه يمكن تسريع الدراسات المورفولوجية أو التبعيات الوظيفية على الطفرات الجينية أو مؤثرات الخارجية ، ويمكن أن الأهم من ذلك ، التقاط صورة كاملة للتنمية أو وظيفة الأنسجة من خلال السماح طولية الوقت الفاصل بين التصور للكائن ، نفس النامية.
تقنية تستخدم المجهر المختبر المحورة والإسقاط متعددة الإضاءة لجمع البيانات على 360 درجة التوقعات. وينطبق ذلك على تبسيط فيرمي إلى حل فوكر بلانك ، من المعادلة النقل الفوتون ، جنبا إلى جنب مع مبادئ البصريات الهندسية من أجل بناء نظام انعكاس واقعي مناسب للمجموعة جرحشاعثزرحشرتاد. هذا يسمح في الجسم الحي ، كامل الجسم التصور هياكل ثلاثية الأبعاد غير شفافة في عينات تصل إلى عدة مليمترات في الحجم.
لقد أثبتنا أداء داخل الجسم الحي بواسطة تقنية التصوير ثلاثي الأبعاد هياكل الأنسجة النامية ذبابة الفاكهة في الجسم الحي ، وذلك من خلال اتباع التشكل من الأجنحة في ذبابة الفاكهة الشرانق مبهمة في الوقت الحقيقي أكثر من ست ساعات متتالية.
Protocol
ومخزونات melanogaster ذبابة الفاكهة المستخدمة في هذه التجربة هي التالية :
- elav - Gal4 (FBti0002575)
- AP - Gal4md544 (FBal0051787)
- UAS - srcEGFP (FBti0013990)
- w1118 (FBal0018186)
لجميع التجارب ، تم استخدام نظام UAS - Gal4 لGFP overexpress في أنسجة الفائدة (أي الغدد اللعابية أو أقراص الجناحين). بشكل أكثر تحديدا ، وعبرت الذباب الإناث وراثيا مع Gal4 المناسبة لزملائه وراثيا UAS - EGFP. وقد تربى الصلبان في 25 درجة مئوية في حاضنة مرطب. وعندما تبدأ الشرانق ملء قارورة (حوالي 5-6 أيام بعد بدء الصليب) ، اختاروا لمضان GFP في هذه المرحلة prepupal البيضاء (0-1 ساعة بعد تشكيل puparium) وجمعت للتصوير المقطعي.
- انشاء تقاطعات والخلفية المناسبة عند 25 درجة مئوية
- 5-6 أيام بعد بدء الصليب ، وتحديد النسل نيون للتصوير. استخدام الفرشاة المبللة لإزالة طيف من prepupae بيضاء من الجانبين من القارورة.
- وضعت وضعت prepupae في قطرة ماء أو برنامج تلفزيوني في طبق بتري لإزالة جزيئات الطعام والغراء والتي تغطي حالة العذراء ويجعل العينة autofluorescent. نظيفة بلطف مع فرشاة الرسم. إذا شيخوخة الشرانق ضروري ، ومكان المحدد prepupae الأبيض في طبق بتري بمنشفة مبللة ورقة (غرفة الرطبة) أو على جانبي قنينة نظيفة مع الطعام الطيران. وهذا ضمان وجود ما يكفي من الرطوبة ، للسماح للتنمية السليمة للحيوانات.
تركيب ذبابة الفاكهة
- الغراء في الجزء السفلي من حالة العذراء في أنبوب زجاجي الشعرية (800 ميكرون قطر) ان هذه الذبابة الأمامي / الخلفي توجه المحور الموازي للأنبوب.
- إصلاح الأنابيب الشعرية عموديا على مرحلة التناوب.
- ضبط محور يميل للمرحلة التناوب من أجل محور الدوران لتكون موازية للأعمدة بكسل من اتفاقية مكافحة التصحر التصوير.
تقرير إعادة توجيه النموذجي
- إصلاح خادرة في كوب الشعرية وجبل كما هو موضح قبل
- ملء أنبوب السيليكا الشعرية (100 ميكرون ، OD) مع صبغة الفلورسنت (Cy5.5)
- إدراج الأنابيب الشعرية داخل الشرنقة الى 45 درجة فيما يتعلق المحور الأمامي / الخلفي
- تضيء خادرة مع الإثارة شعاع الليزر مع فتحة عدسة رقمية منخفضة. جمع الصور تضوء مضان أكثر من 360 درجة تناوب على طول خادرة محورها العمودي.
- احتواء البيانات التجريبية مع موديلا لأحد قدما المناسبة
الغدد اللعابية التصوير
- شن GFP خادرة الإعراب في الغدد اللعابية كما هو موضح قبل
- شعاع يضيء مع الإثارة وجمع تضوء في إشارة مضان GFP أكثر من 360 درجة تناوب على طول خادرة محورها العمودي.
- إعادة بناء البيانات التي حصل عليها الاستفادة من النموذج إلى الأمام
الوقت الفاصل بين التصوير
- شن GFP prepupa الأبيض في التعبير عن الأقراص وتخيلي الجناح
- الحفاظ على البيئة الرطبة ، والتصوير في درجة حرارة الغرفة لتجنب الجفاف للخادرة.
- وضع مصراع الكاميرا لتجنب الإضاءة المستمرة
- شعاع يضيء مع الإثارة وجمع تضوء في إشارة مضان GFP أكثر من 360 درجة تناوب على طول خادرة محورها العمودي.
- إعادة بناء البيانات التي حصل عليها الاستفادة من النموذج إلى الأمام.
الأنسجة
- تشريح الغدد اللعابية CNS / أقراص العين في برنامج تلفزيوني 1X.
- إصلاح الأنسجة في فورمالديهايد 4 ٪ ، 1X بيم (مواسير 100mM ، 1MM EGTA ، 1MM MgCl 2) ل20min في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة التثبيت وجبل في Vectashield مع دابي (ناقلات)
- صورة مع المجهر الفلورسنت.
الوقت الفاصل بين الأنسجة
- جمع البيض ومرحلة prepupae منهم في غرفة رطبة.
- جمع الشرانق في مراحل تنموية مختلفة
- وخز حالة العذراء مرتين (0 ساعات بعد تشكيل Puparium) مع غرامة إبرة (دبوس الحشرات ، 000 FST) قبل التثبيت.
- الإصلاح الشرانق في فورمالديهايد 8 ٪ ، 1X لمدة 6-8 ساعات بيم في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
- بعد إزالة التثبيت والشطف مع 1X PBS ، قطع خادرة الثابتة بشفرة حادة في اثنين قطع على محور عمودي A / P ؛
- غمر قطعتين في Vectashield مع دابي (ناقلات) وجبل على الشرائح ساترة (لاب تيك) للتصوير.
- الحصول على صور مع مجهر متحد البؤر مضان.
الشكل 1. الرجاء انقر هنا لرؤية بنarger نسخة من الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
داخل الجسم الحي اعادة البناء في القضية العذراء والغدد اللعابية GFP - معربا عن وجود دال هو مبين في الشكل رقم 1 (أ) ؛ melanogaster prepupa (المقياس بار ، 500 ميكرون) مع الأنسجة المقابلة (الأخضر والأزرق GFP مضان ، تلوين دابي). الوقت الفاصل بين التصوير سلسلة من دال ويرد melanogaster الجناح أقراص تخيلي في Fig.1 (ب). يتم الحصول على الصور من عينة واحدة على الهواء مباشرة ، في أربع نقاط زمنية مختلفة (0،3.0 و 3.5 ساعات 6.5). في إسقاط أول واحد في العمود 0 درجة مع احترام لعرض خادرة في ظهري هو مبين. في العمود الثاني في إعادة بناء تتوافق مع الفروع المشار إليها بواسطة خطوط حمراء. أخيرا ، تظهر المقارنة مع الأنسجة العمود الثالث. بوضوح ، والتحضيرات النسيجية تتطابق جيدا مع عمليات إعادة تصوير الشعاعي الطبقي. في الصورة مستو (ج) من ذبابة الفاكهة في الحالة العذراء والغدد اللعابية GFP - الإعراب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
جيم Vinegoni يقر بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة - 1 - RO1 EB006432.
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
