Мезоскопические флуоресцентная томография для В естественных условиях Изображений развивающихся Drosophila Published: August 20, 2009 doi: 10.3791/1510

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Claudio Vinegoni¹, Daniel Razansky², Chrysoula Pitsouli³, Norbert Perrimon³, Vasilis Ntziachristos², Ralph Weissleder¹

¹Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, ²Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Technical University of Munich and Helmholtz Center Munich, ³Department of Genetics, Harvard Medical School and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Мезоскопические флуоресценции томографии работает за пределы проникновения ткани срезов флуоресцентной микроскопии. Методика основана на мульти-проекции освещением и фотонной описание транспорта. Мы демонстрируем в естественных условиях всего тела 3D визуализация морфогенеза GFP-экспрессирующих крыло имагинальных дисков

Protocol

Дрозофилы запасы, используемые в данном эксперименте являются следующие:

• elav-Gal4 (FBti0002575)
• AP-Gal4md544 (FBal0051787)
• UAS-srcEGFP (FBti0013990)
• w1118 (FBal0018186)

Для всех экспериментов, UAS-Gal4 система была использована для гиперэкспрессией GFP в ткани интерес (т.е. слюнных желез или крыло диски). В частности, самок трансгенных с соответствующим Gal4 были скрещены на UAS-EGFP трансгенных товарищей. Крестов было выращено при 25 ° С в увлажненной инкубатора. Когда куколки начать заполнение флаконах (примерно 5-6 дней после начала крест), они были отобраны для GFP флуоресценции при белом prepupal этапе (0-1 ч после формирования пупария) и собранных для томографии.

1. Настройка соответствующие кресты и задних при 25 ° С
2. 5-6 дней после начала крест, выберите флуоресцентные потомства для работы с изображениями. Использование мокрой кистью для нежного удаления белого предкуколок из сторон флаконе.
3. Положите предкуколок в капле воды или PBS размещены в чашке Петри, чтобы удалить частицы пищи и клей, который охватывает куколки дело и делает образца autofluorescent. Аккуратно очистите кисть. Если старение куколки необходимо, место, выбранное белый предкуколок в чашку Петри с мокрым бумажным полотенцем (влажной камере), либо по бокам чистый флакон с летучей пищи. Это будет гарантировать, что есть достаточно влаги, чтобы обеспечить правильное развитие животного.

Монтаж дрозофилы

1. Клей нижней части куколки случае в капиллярной стеклянной трубки (800 микрон в диаметре), что передняя / задняя ось мухи ориентирована параллельно трубе.
2. Fix капиллярной трубке вертикально на ротационной стадии.
3. Отрегулируйте наклон оси вращательное этапе для того, чтобы оси вращения должны быть параллельны пикселей колонны изображения CCD.

Модель определения Вперед

1. Fix куколки в капиллярной стеклянной и смонтировать, как описано выше
2. Заполните кварцевую капиллярную трубку (100 микрон, О. Д.) с флуоресцентным красителем (Cy5.5)
3. Вставьте капилляр внутри куколки при температуре 45 градусов по отношению к передней / задней оси
4. Illuminate куколки с пучком лазерного возбуждения с низкой числовой апертуры линзы. Сбор флуоресцентные изображения просвечивание более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
5. Fit экспериментальных данных с соответствующими вперед модель

Изображений слюнных желез

1. Горы куколки выражения GFP в слюнных железах, как описано выше
2. Illuminate с возбуждением пучка и собирать в просвечивание сигнала флуоресценции GFP более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
3. Реконструкция приобретенных данных с использованием передовых моделей

Time-Lapse изображений

1. Горы белых prepupa выражения GFP в крыле имагинальных дисков
2. Держите изображений среды влажных и при комнатной температуре, чтобы избежать обезвоживания куколки.
3. Место выдержки, чтобы избежать непрерывного освещения
4. Illuminate с возбуждением пучка и собирать в просвечивание сигнала флуоресценции GFP более 360 градусов вращающийся куколки вдоль его вертикальной оси.
5. Реконструкция приобретенных данных с использованием модели вперед.

Гистология

1. Рассеките слюнных желез ЦНС / глаз диски 1x PBS.
2. Fix тканей в 4% формальдегида, 1x PEM (100 мм трубы, 1мМ EGTA, 1мМ MgCl ₂₎ для 20 минут при комнатной температуре.
3. Удалить фиксации и установки в Vectashield с DAPI (вектор)
4. Изображение с флуоресцентным микроскопом.

Time-Lapse Гистология

1. Сбор белых предкуколок и стадии их во влажной камере.
2. Сбор куколки на разных стадиях развития
3. Укол куколки случае в два раза (0 часов после Пупарий свита) с помощью тонкой иглы (насекомое контактный 000, ФСТ) до фиксации.
4. Fix куколки в 8% формальдегида, 1x PEM в течение 6-8 часов при комнатной температуре при легком помешивании.
5. После снятия фиксации и промывки 1x PBS, вырезать фиксированной куколки с острым лезвием на две части перпендикулярно оси / P;
6. Погрузите две штуки в Vectashield с DAPI (вектор) и смонтировать на покровного стекла слайдов (Lab-Tek) для работы с изображениями.
7. Получение изображений с флуоресценции конфокальной микроскопии.

Рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы увидеть др.arger версия рисунке 1.

Discussion

В естественных условиях реконструкции куколки дела и GFP-экспрессирующих слюнных желез D. MELANOGASTER prepupa (Масштаб бар, 500 мкм) с соответствующими гистологии (синий, DAPI окрашивания; зеленый, GFP флуоресценции) показана на рис 1 (а). Покадровый серии изображений D. MELANOGASTER крыло имагинальных дисков показана на рис.1 (б). Изображения, приобретенные у одного живого образца, на четырех различных моментов времени (0,3.0, 3,5 и 6,5 часа). В первой колонке одной проекции при 0 градусов по отношению к спинной куколки является показано на рисунке. Во второй колонке реконструкции соответствуют разделам указывается красными линиями. Наконец, по сравнению с гистологии показано третьей колонке. Очевидно, гистологических препаратах хорошо коррелируют с томографической реконструкции. В (в) плоские образе куколки случае дрозофилы и GFP-экспрессирующих слюнных желез.