Summary
Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף ב
Abstract
חזותי היווצרות איברים פיתוח וכן progession והטיפול במחלות לעתים קרובות בכבדות מסתמך על היכולת לחקור אופטית השינויים המולקולריים ופונקציונלי אורגניזמים חיים שלמים. קיים רוב שיטות דימות אופטי אינם מספיקים עבור הדמיה בכל הממדים החבויים בין גבולות החדירה של מיקרוסקופיה אופטית מודרנית (0.5-1 מ"מ) לבין דיפוזיה שכפה מגבלות macroscopy אופטי (> 1cm) [1]. לכן, רבים אורגניזמים מודל חשוב, חרקים למשל, עוברים בעלי החיים או הגפיים חיים קטן, להישאר נגיש עבור הדמיה ב-vivo אופטי.
למרות שיש התעניינות גוברת לקראת פיתוח של ננומטר ברזולוציה שיטות הדמיה אופטית, לא נעשו מאמצים רבים מצליחים לשפר את עומק החדירה הדמיה. היכולת לבצע ב-vivo הדמיה מעבר לגבולות מיקרוסקופיה היא למעשה נפגש עם קשיים הקשורים פיזור פוטון נוכח ברקמות. מאמצים אחרונים כדי עוברי התמונה כולה, למשל [2,3] דורשים טיפול כימי מיוחד של הדגימה, כדי לנקות אותם מן הפיזור, הליך שגורם להם מתאים רק הדמיה פוסט מורטם. אולם שיטות אלו ראיות לצורך דגימות הדמיה גדולים מאלה מותר בדרך כלל על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים או confocal, בעיקר בביולוגיה התפתחותית של גילוי תרופות.
פיתחנו שיטה חדשה הדמיה אופטית בשם Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה [4], אשר מתאים הדמיה ב-vivo פולשני בכל הממדים של 1mm-5mm. בורסות שיטה ברזולוציה של עומק החדירה, אך מציע ביצועים חסרי תקדים טומוגרפית הדמיה והיא פותחה כדי להוסיף הזמן כמימד חדש תצפיות בביולוגיה התפתחותית (ובאזורים אחרים ואולי של המחקר הביולוגי) על ידי הקניית יכולת תמונת האבולוציה של הקרינה, מתויג התגובות לאורך זמן. ככזה הוא יכול להאיץ מחקרים של תלות מורפולוגית או תפקודית על מוטציות גנטיות או גירויים חיצוניים, והוא יכול חשוב, ללכוד את התמונה המלאה של התפתחות או תפקוד הרקמות בכך שהוא מאפשר הדמיית האורך זמן לשגות של האורגניזם, אותו פיתוח.
הטכניקה מנצלת מיקרוסקופ במעבדה שונה ורב הקרנת תאורה כדי לאסוף נתונים על 360 מעלות תחזיות. זה מחיל את פישוט פרמי לפתרון-Plank Fokker של המשוואה תחבורה פוטון, בשילוב עם עקרונות האופטיקה הגיאומטרית על מנת לבנות תוכנית היפוך ריאליסטי מתאים למגוון mesoscopic. זה מאפשר ב-vivo כל הגוף להדמיה הלא שקוף תלת מימדי מבנים בדגימות של עד מספר מ"מ בגודל.
אנחנו הוכיחו את הביצועים ב-vivo של הטכניקה על ידי הדמיה תלת ממדית של מבנים בפיתוח רקמות תסיסנית ב-vivo ועל ידי ביצוע המורפוגנזה של הכנפיים של אטום תסיסנית גלמים בזמן אמת במשך שש שעות רצופות.
Protocol
Melanogaster מניות תסיסנית השתמשו בניסוי זה הם:
- elav-Gal4 (FBti0002575)
- AP-Gal4md544 (FBal0051787)
- כטב"מ-srcEGFP (FBti0013990)
- w1118 (FBal0018186)
עבור כל הניסויים, המערכת כטב"מ-Gal4 שימש overexpress GFP ברקמות של עניין (כלומר, בלוטות הרוק או את הדיסקים כנף). באופן ספציפי יותר, זבובים נקבה מהונדס עם Gal4 המתאים פזלו אל כטב"מ-EGFP זוג מהונדס. הצלבים היו מגדלים של 25 מעלות צלזיוס חממה humidified. כאשר גלמים להתחיל לאכלס את צלוחיות (כ 5-6 ימים לאחר תחילת הצלב), הם נבחרו GFP הקרינה בשלב prepupal לבן (0-1 שעות לאחר היווצרות puparium) ואסף עבור טומוגרפיה הדמיה.
- הגדר חוצה המתאים האחורי של 25 ° C
- 5-6 ימים לאחר תחילת הצלב, בחר הצאצאים פלורסנט הדמיה. שימוש במכחול רטוב להסרה עדינה של prepupae הלבן מן הצדדים של הבקבוקון.
- שים prepupae בטיפת מים או PBS להציב בצלחת פטרי כדי להסיר חלקיקי מזון הדבק מכסה את המקרה גלמי ועושה הדגימה autofluorescent. לנקות בעדינות עם מכחול. אם ההזדקנות של גלמים הוא הכרחי, המקום שנבחר prepupae לבן בצלחת פטרי עם מגבת נייר רטובה (תא לח) או בצידי בקבוקון נקי עם אוכל לעוף. זה יבטיח כי יש מספיק לחות, כדי לאפשר התפתחות תקינה של החיה.
תסיסנית הרכבה
- דבק את החלק התחתון של התיק גלמי לתוך צינור זכוכית נימי (800 מיקרון קוטר) כך קדמית / אחורית של הזבוב ציר מכוונת במקביל הצינור.
- לתקן את צינור נימי אנכית על הבמה הסיבוב.
- כוון את הטיית ציר הסיבוב של הבמה כדי ציר הסיבוב להיות במקביל עמודות פיקסלים של CCD הדמיה.
קדימה מודל קביעת
- תקן גולם בכוס נימי הר כפי שתואר קודם
- מלא צינור נימי סיליקה (100 מיקרון, OD) עם פלורסנט לצבוע (Cy5.5)
- הכנס את צינור נימי בתוך גולם ב 45 מעלות ביחס לציר הקדמי / אחורי
- להאיר את גולם עם אלומת לייזר עירור עם עדשה צמצם נמוך מספרית. איסוף תמונות שקוף הקרינה מעל 360 מעלות סיבוב גולם לאורך הציר האנכי שלה.
- התאימו את נתוני הניסוי עם הדגם המתאים קדימה
הדמיה בלוטות הרוק
- הר GFP גולם להביע את בלוטות הרוק כפי שתואר קודם
- להאיר עם קרן עירור לאסוף ב שקוף את האות פלואורסצנציה GFP מעל 360 מעלות סיבוב גולם לאורך הציר האנכי שלה.
- לשחזר את הנתונים רכשה ניצול מודל קדימה
זמן לשגות הדמיה
- הר GFP לבן prepupa לבטא את הדיסקים דמותי כנף
- לשמור על סביבת הדמיה לח בטמפרטורת החדר כדי למנוע התייבשות של גולם.
- המקום תריס להימנע תאורה רציפה
- להאיר עם קרן עירור לאסוף ב שקוף את האות פלואורסצנציה GFP מעל 360 מעלות סיבוב גולם לאורך הציר האנכי שלה.
- לשחזר את הנתונים רכשה ניצול מודל קדימה.
היסטולוגיה
- לנתח בלוטות הרוק CNS / דיסקים העין 1x PBS.
- תיקון רקמות בפורמלין 4%, 1x PEM (צינורות 100mm, 1mm EGTA, 1mm MgCl 2) עבור 20min בטמפרטורת החדר.
- הסרת קיבוע ו הר ב Vectashield עם dapi (וקטור)
- תמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
זמן לשגות היסטולוגיה
- איסוף prepupae לבן הבמה אותם בתא לח.
- איסוף גלמים בשלבים התפתחותיים שונים
- דקרו את המקרה גלמי פעמיים (0 שעות לאחר כינונה Puparium) עם מחט עדינה (000 פינים חרקים, FST) לפני קיבעון.
- תקן גלמים ב 8% פורמלדהיד, 1x PEM במשך 6-8 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
- לאחר הסרת קיבוע ושטיפה עם 1x PBS, לחתוך את גולם קבוע עם סכין חדה שתי חתיכות בניצב לציר / P;
- להטביע את שתי חתיכות ב Vectashield עם dapi (וקטור) לבין הר בשקופיות coverglass (Lab-Tek) עבור הדמיה.
- לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal.
באיור 1. אנא לחץ כאן כדי לראות אלarger גירסה של דמות 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In-vivo שחזורים של המקרה גלמי ו-GFP להביע בלוטות הרוק של ד melanogaster prepupa (סולם בר, 500 מיקרון) עם היסטולוגיה המקביל (כחול, מכתים dapi, ירוק, GFP פלואורסצנטי) מוצג באיור 1 (א). זמן לשגות הדמיה של סדרה ד ' melanogaster כנף דיסקים דמותי מוצגת תמונה 1 (ב). התמונות הן רכשה דגימה חיה אחת, בארבע נקודות זמן שונות (0,3.0, 3.5, ו - 6.5 שעות). במהלך הקרנת first עמודה אחת ב 0 מעלות ביחס להציג הגבי של גולם מוצג. בעמודה השנייה שחזורים תואמים את החלקים מסומנים על ידי הקווים האדומים. לבסוף, השוואה עם היסטולוגיה מוצג בעמודה השלישית. ברור, את ההכנות היסטולוגית לתאם היטב עם שחזורים טומוגרפית. בתמונה מישוריים (ג) במקרה גלמי של תסיסנית ו-GFP להביע בלוטות הרוק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ג Vinegoni מודה תמיכה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק 1-RO1-EB006432.
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
