Summary
Mesoscopici fluorescenza tomografia opera oltre i limiti di penetrazione del tessuto-sezionamento microscopia a fluorescenza. La tecnica è basata su multi-proiezione di illuminazione e una descrizione di trasporto fotone. Abbiamo dimostrato in vivo di tutto il corpo visualizzazione 3D della morfogenesi della GFP che esprimono ala dischi immaginale in
Abstract
Visualizzazione formazione degli organi di sviluppo così come progession e trattamento della malattia spesso si basa pesantemente sulla capacità di interrogare otticamente cambiamenti molecolari e funzionali negli organismi viventi intatti. La maggior parte delle attuali metodi di imaging ottico sono inadeguati per l'imaging a dimensioni che si trovano tra i limiti di penetrazione della moderna microscopia ottica (0,5-1mm) e la diffusione imposto limiti di macroscopia ottica (> 1 cm) [1]. Così, molti organismi modello importante, ad esempio insetti, embrioni animali o delle estremità piccolo animale, restano inaccessibili per in vivo imaging ottico.
Anche se vi è un crescente interesse verso lo sviluppo di metodi di risoluzione nanometrica imaging ottico, non ci sono stati molti gli sforzi di successo per migliorare la profondità di penetrazione di imaging. La capacità di eseguire l'imaging in vivo oltre i limiti microscopia è infatti incontrato con le difficoltà associate con dispersione di fotoni presenti nei tessuti. Recenti tentativi di embrioni intera immagine per esempio [2,3] richiedono un trattamento speciale chimica del campione, per eliminarli dallo scattering, una procedura che li rende adatti solo per la post-mortem di imaging. Questi metodi tuttavia evidenza la necessità di esemplari immagini più grandi di quelle normalmente consentite dalla microscopia a due fotoni o confocale, in particolare in biologia dello sviluppo e nella scoperta della droga.
Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di imaging ottico chiamato mesoscopici fluorescenza Tomografia [4], che appropriato per non invasiva in vivo immagini a dimensioni di 1mm-5mm. La risoluzione metodo scambi per profondità di penetrazione, ma offre prestazioni di imaging tomografico senza precedenti ed è stato sviluppato per aggiungere il tempo come una nuova dimensione nelle osservazioni biologia dello sviluppo (e forse altre aree di ricerca biologica), donando la possibilità di immagine l'evoluzione della fluorescenza tagged risposte nel tempo. Come tale, può accelerare gli studi delle dipendenze morfologiche o funzionali a mutazioni genetiche o stimoli esterni, e può, soprattutto, acquisire il quadro completo dello sviluppo o della funzione dei tessuti, permettendo longitudinale time-lapse visualizzazione degli stessi, organismo di sviluppo.
La tecnica utilizza un microscopio da laboratorio modificati e multi-proiezione di illuminazione per raccogliere i dati a 360 gradi proiezioni. Si applica la semplificazione Fermi di Fokker-Plank soluzione dell'equazione di trasporto di fotoni, in combinazione con i principi dell'ottica geometrica al fine di costruire un piano realistico inversione adatti per la gamma mesoscopici. Ciò consente di in-vivo di tutto il corpo visualizzazione di non trasparente strutture tridimensionali in campioni fino a diversi millimetri di dimensione.
Abbiamo dimostrato in vivo le prestazioni della tecnica di imaging di strutture tridimensionali di sviluppare tessuti Drosophila in vivo e seguendo la morfogenesi delle ali nel opaco Drosophila pupe in tempo reale oltre sei ore consecutive.
Protocol
Le scorte di Drosophila melanogaster utilizzati in questo esperimento sono i seguenti:
- ELAV-GAL4 (FBti0002575)
- ap-Gal4md544 (FBal0051787)
- SUP-srcEGFP (FBti0013990)
- w1118 (FBal0018186)
Per tutti gli esperimenti, le scuole universitarie professionali-GAL4 sistema è stato utilizzato per iperespressione di GFP nel tessuto di interesse (ad esempio le ghiandole salivari o dischi di ala). Più in particolare, le mosche femmina transgenici con l'apposito GAL4 furono incrociati a UAS-EGFP compagni transgenici. Le croci sono stati allevati a 25 ° C in un incubatore umidificato. Quando pupe iniziare popolare le fiale (circa 5-6 giorni dopo l'inizio della croce), sono stati selezionati per la fluorescenza GFP in fase di bianco prepupal (0-1 ore dopo la formazione puparium) e raccolti per la tomografia di imaging.
- Impostare attraversa appropriati e posteriore a 25 ° C
- 5-6 giorni dopo l'inizio della croce, selezionare progenie fluorescenti per l'imaging. Utilizzare un pennello umido per la rimozione delicata della prepupae bianco dai lati della fiala.
- Mettere prepupae in una goccia d'acqua o PBS posto in una capsula di Petri per rimuovere le particelle di cibo e la colla che copre il caso pupa e rende il campione autofluorescenti. Pulire delicatamente con un pennello. Se l'invecchiamento delle pupe è necessario, luogo scelto prepupae bianco in una capsula di Petri con un tovagliolo di carta umido (camera umida) o ai lati di una cuvetta pulita con il cibo volare. Questo farà sì che vi sia umidità sufficiente, per consentire un corretto sviluppo dell'animale.
Drosophila montaggio
- Colla nella parte inferiore del case pupa in un tubo capillare di vetro (800 micron di diametro) in modo che la mosca anteriore / posteriore asse è orientato parallelamente al tubo.
- Fissare il tubo capillare in verticale su un palcoscenico di rotazione.
- Regolare l'inclinazione dell'asse della fase di rotazione in modo che l'asse di rotazione deve essere parallela alle colonne pixel del CCD.
Modello di determinazione in avanti
- Fissare una pupa in un capillare di vetro e montare come descritto in precedenza
- Riempire un tubo capillare di silice (100 micron, OD) con un colorante fluorescente (Cy5.5)
- Inserire il tubo capillare all'interno della pupa a 45 gradi rispetto alla anteriore / posteriore asse
- Illuminare la pupa con un fascio laser di eccitazione con una lente a bassa apertura numerica. Raccogliere immagini transilluminazione fluorescenza a 360 gradi di rotazione la pupa lungo il suo asse verticale.
- Montare i dati sperimentali con un modello appropriato in avanti
Le ghiandole salivari Imaging
- Montare un GFP pupa che esprime nelle ghiandole salivari, come descritto prima
- Illuminare con un fascio di eccitazione e raccogliere in transilluminazione il segnale di fluorescenza GFP su 360 gradi di rotazione la pupa lungo il suo asse verticale.
- Ricostruire i dati acquisiti utilizzando il modello in avanti
Time-Lapse Imaging
- Montare un GFP bianco prepupa esprimendo nei dischi ala immaginale
- Mantenere l'ambiente umido e di imaging a temperatura ambiente per evitare la disidratazione della pupa.
- Posizionare un otturatore per evitare l'illuminazione continua
- Illuminare con un fascio di eccitazione e raccogliere in transilluminazione il segnale di fluorescenza GFP su 360 gradi di rotazione la pupa lungo il suo asse verticale.
- Ricostruire i dati acquisiti utilizzando il modello in avanti.
Istologia
- Sezionare SNC ghiandole salivari / dischi occhio in 1x PBS.
- Fissare i tessuti nel 4% di formaldeide, 1x PEM (Tubi 100mM, 1MM EGTA, 1mm MgCl 2) per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere fissaggio e montaggio in Vectashield con DAPI (Vector)
- Immagine con un microscopio a fluorescenza.
Time-Lapse Istologia
- Raccogliere prepupae bianco e lo stadio in una camera umida.
- Raccogliere pupe a diversi stadi di sviluppo
- Cazzo il caso pupa due volte (0 ore dopo la formazione Puparium) con un ago sottile (insetti pin 000, FST) prima di fissazione.
- Fissare pupe in 8% di formaldeide, 1x PEM per 6-8 ore a temperatura ambiente e scuotendo con cautela.
- Dopo la rimozione di fissazione e risciacquo con PBS 1x, tagliare il fisso pupa con una lama affilata in due pezzi perpendicolari all'asse A / P;
- Immergere i due pezzi in Vectashield con DAPI (Vector) e montare su vetrini coprioggetti (Lab-Tek) per l'imaging.
- Acquisire le immagini con un microscopio a fluorescenza confocale.
Figura 1. Si prega di cliccare qui per vedere alarger versione della figura 1.
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Discussion
In vivo ricostruzioni del caso pupa e la GFP che esprimono ghiandole salivari di una D. melanogaster prepupa (Scala bar, 500 micron) con l'istologia corrispondente (blu, colorazione DAPI, verde, GFP fluorescenza) è mostrato in Fig. 1 (a). Time-lapse imaging di serie D. melanogaster ala dischi immaginale è mostrata in Fig.1 (b). Le immagini vengono acquisite da un singolo esemplare dal vivo, in quattro momenti diversi (0,3.0, 3,5 e 6,5 ore). Nella prima colonna una proiezione a 0 gradi rispetto alla vista dorsale la pupa è mostrato. Nella seconda colonna le ricostruzioni corrispondono alle sezioni indicate dalle linee rosse. Infine, un confronto con l'istologia è indicato nella terza colonna. Chiaramente, i preparati istologici correlano bene con le ricostruzioni tomografiche. In (c) immagine planare del caso pupa uno Drosophila e la GFP che esprimono ghiandole salivari.
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Acknowledgments
C. Vinegoni riconosce il sostegno di National Institutes of Health (NIH) concedere 1-RO1-EB006432.
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
