Summary
Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven in
Abstract
Visualiseren van het ontwikkelen van orgel vorming evenals progession en de behandeling van de ziekte vaak zwaar leunt op de mogelijkheid om optisch te ondervragen moleculaire en functionele veranderingen in intacte levende organismen. De meeste bestaande optische beeldvorming methoden zijn niet voldoende voor de beeldvorming op de afmetingen die liggen tussen de penetratie grenzen van de moderne optische microscopie (0,5-1mm) en de verspreiding opgelegde grenzen van optische macroscopie (> 1 cm) [1]. Dus veel belangrijke modelorganismen, bijvoorbeeld insecten, dierlijke embryo's of kleine dieren extremiteiten, ontoegankelijk blijven voor in-vivo optische beeldvorming.
Hoewel er steeds meer belangstelling aan de ontwikkeling van nanometer-resolutie optische beeldvorming methoden, zijn er niet al veel succesvolle inspanningen in het verbeteren van de beeldvorming penetratie diepte. De mogelijkheid om in-vivo beeldvorming uit te voeren buiten microscopie grenzen is in feite een ontmoeting met de moeilijkheden in verband met foton verstrooiing aanwezig in weefsels. Recente inspanningen om de afbeelding gehele embryo's voor bijvoorbeeld [2,3] vereisen speciale chemische behandeling van het monster, om ze te verwijderen uit verstrooiing, een procedure waardoor ze alleen geschikt voor post-mortem beeldvorming. Deze methoden echter het bewijs van de noodzaak voor imaging grotere exemplaren dan degene die meestal toegelaten door twee-foton of confocale microscopie, in het bijzonder in de ontwikkelingsbiologie en in drug discovery.
We hebben een nieuwe optische beeldvormende techniek genaamd Mesoscopische Fluorescentie Tomografie [4], die geschikt zijn voor niet-invasieve in-vivo beeldvorming op de afmetingen van 1mm-5mm. De methode uitwisselingen resolutie voor indringdiepte, maar biedt ongekende tomografische beeldvorming prestaties en het is ontwikkeld om tijd toe te voegen als een nieuwe dimensie in de ontwikkelingsbiologie waarnemingen (en eventueel tot andere gebieden van biologisch onderzoek) door het verlenen van de mogelijkheid om het imago van de evolutie van de fluorescentie- getagd reacties in de tijd. Als zodanig kan versnellen studies van morfologische of functionele afhankelijkheden op gen-mutaties of externe stimuli, en kan belangrijker, vangen het complete beeld van de ontwikkeling of weefsel functie doordat lengterichting time-lapse visualisatie van het zelfde, ontwikkelende organisme.
De techniek maakt gebruik van een aangepaste laboratorium microscoop en multi-projectie verlichting om gegevens te verzamelen bij 360 graden projecties. Het geldt de Fermi vereenvoudiging Fokker-Plank oplossing van het foton vervoer vergelijking, in combinatie met geometrische optica principes om een realistische inversie dat geschikt is voor mesoscopische assortiment op te bouwen. Dit maakt in-vivo visualisatie van het gehele lichaam van niet-transparante drie-dimensionale structuren in monsters tot enkele millimeters groot.
We hebben aangetoond dat de in-vivo de prestaties van de techniek via imaging drie-dimensionale structuren van de ontwikkeling van Drosophila weefsels in-vivo en door het volgen van de morfogenese van de vleugels in de ondoorzichtige Drosophila poppen in real-time meer dan zes uur achtereen.
Protocol
De Drosophila melanogaster voorraden die in dit experiment zijn de volgende:
- elav-Gal4 (FBti0002575)
- ap-Gal4md544 (FBal0051787)
- UAS-srcEGFP (FBti0013990)
- w1118 (FBal0018186)
Voor alle experimenten werd de UAS-Gal4 systeem gebruikt om de overexpressie GFP in het weefsel van de rente (dat wil zeggen de speekselklieren of de vleugel discs). Meer specifiek werden de vrouwtjes transgene met de juiste Gal4 overgestoken naar UAS-EGFP transgene mates. De kruisen zijn gefokt bij 25 ° C in een bevochtigde incubator. Bij de poppen start het vullen van de flesjes (ongeveer 5-6 dagen na aanvang van het kruis), werden ze geselecteerd voor GFP fluorescentie bij de witte prepupal stadium (0-1 uur na puparium vorming) en verzameld voor tomografie beeldvorming.
- Opzetten van passende kruisen en achterkant bij 25 ° C
- 5-6 dagen na het begin van het kruis, selecteer fluorescerende nageslacht voor de beeldvorming. Gebruik een natte kwast voor een zachte verwijdering van de witte prepupae van de zijkanten van de flacon.
- Doe prepupae in een druppel water of PBS geplaatst in een petrischaaltje voedsel deeltjes en de lijm die het popstadium geval dekt en maakt het monster autofluorescente te verwijderen. Voorzichtig schoon met een penseel. Als veroudering van de poppen is noodzakelijk, plaats geselecteerde witte prepupae in een petrischaal met een natte papieren handdoek (een vochtige kamer), of aan de zijkanten van een schoon flesje met fly voedsel. Dit zal ervoor zorgen dat er genoeg vocht, om een goede ontwikkeling van het dier mogelijk te maken.
Drosophila Montage
- Lijm het onderste deel van het popstadium zaak in een capillaire glazen buis (800 micron diameter) zodanig dat de vlieg anterior / posterior-as is gericht parallel aan de buis.
- Verticaal vast de capillaire buis op een roterende podium.
- Pas de kantelen as van de rotatie-podium, zodat de rotatie-as parallel aan de pixel kolommen van de beeldvormende CCD.
Vaststelling Forward Model
- Fix een pop in een capillair glas en monteren zoals eerder beschreven
- Vul een silica capillair (100 micron, OD) met een fluorescerende kleurstof (Cy5.5)
- Plaats de capillair in de pop van 45 graden ten opzichte van de voorste / achterste as
- Verlichten de pop met een excitatie laserstraal met een lage numerieke apertuur lens. Verzamel fluorescentie transilluminatie beelden over 360 graden draaien van de pop langs de verticale as.
- Passen bij de experimentele data met een geschikte voorwaartse model
Imaging speekselklieren
- Monteer een pop te drukken GFP in de speekselklieren zoals eerder beschreven
- Verlichten met een excitatie balk en verzamelen in transilluminatie het GFP-fluorescentie-signaal over 360 graden draaien van de pop langs de verticale as.
- Reconstrueren van de verkregen gegevens gebruik te maken van de voorwaartse model
Time-Lapse Imaging
- Monteer een witte prepupa uitdrukken GFP in de vleugel denkbeeldige schijven
- Houd de imaging-omgeving vochtig en bij kamertemperatuur om uitdroging van de pop te voorkomen.
- Plaats een sluitertijd tot continue verlichting te vermijden
- Verlichten met een excitatie balk en verzamelen in transilluminatie het GFP-fluorescentie-signaal over 360 graden draaien van de pop langs de verticale as.
- Reconstrueren van de verkregen gegevens gebruik te maken van het voorwaartse model.
Histologie
- Ontleden speekselklieren CNS / oog schijven in 1x PBS.
- Fix weefsels in 4% formaldehyde, 1x PEM (100mm Pipes, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2) voor 20min bij kamertemperatuur.
- Verwijder de fixatie en monteren in Vectashield met DAPI (Vector)
- Afbeelding met een fluorescentiemicroscoop.
Time-Lapse Histologie
- Verzamel witte prepupae en podium ze in een vochtige kamer.
- Verzamel poppen in de verschillende ontwikkelingsstadia
- Prik het popstadium geval twee keer (0 uur Na Puparium Formatie) met een fijne naald (insect pin 000, FST) voor de fixatie.
- Fix poppen in 8% formaldehyde, 1x PEM voor 6-8 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Na verwijdering van fixatie en spoelen met 1x PBS, snij de vaste pop met een scherp mes in twee stukken loodrecht op de A / P-as;
- Dompel de twee stukken in Vectashield met DAPI (Vector) en op dekglaasje dia's (Lab-Tek) voor de beeldvorming.
- Acquire beelden met een fluorescentie confocale microscoop.
Figuur 1. Alstublieft Klik hier om al te zienarger versie van figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In-vivo reconstructies van het popstadium zaak en de GFP expressie speekselklieren van een D. melanogaster prepupa (Schaal bar, 500 micron) met de bijbehorende histologie (blauw, DAPI kleuring, groen, GFP fluorescentie) is weergegeven in figuur 1 (a). Time-lapse serie beeldvorming van D. melanogaster vleugel verbeelding schijven wordt weergegeven in figuur 1 (b). De beelden worden verworven van een enkel levend exemplaar, op vier verschillende tijdstippen (0,3.0, 3.5, en 6,5 uur). In de eerste kolom een projectie op 0 graden ten opzichte van dorsaal zicht van de pop is weergegeven. In de tweede kolom de reconstructies komen overeen met de secties aangegeven door de rode lijnen. Ten slotte wordt een vergelijking met de histologie blijkt de derde kolom. Het is duidelijk, de histologische voorbereidingen correleren goed met de tomografische reconstructies. In (c) vlakke beeld van popstadium geval een Drosophila en het GFP-expressie speekselklieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
C. Vinegoni erkent steun van de National Institutes of Health (NIH) subsidie 1-RO1-EB006432.
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
