Mesoskopisk Fluorescens Tomografi för In-vivo Imaging för att utveckla Drosophila Published: August 20, 2009 doi: 10.3791/1510

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Claudio Vinegoni¹, Daniel Razansky², Chrysoula Pitsouli³, Norbert Perrimon³, Vasilis Ntziachristos², Ralph Weissleder¹

¹Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, ²Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Technical University of Munich and Helmholtz Center Munich, ³Department of Genetics, Harvard Medical School and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Mesoskopisk fluorescens tomografi verkar bortom penetration gränserna för vävnads-snittning fluorescensmikroskopi. Tekniken bygger på multi-projektion belysning och en foton transporter beskrivning. Vi visar in-vivo hela kroppen 3D-visualisering av morfogenes av GFP-uttryckande wing imaginal skivor i

Abstract

Visualisering utveckla organ bildas liksom progession och behandling av sjukdomen ofta starkt beroende av förmågan att optiskt förhöra molekylära och funktionella förändringar i intakta levande organismer. De flesta befintliga optisk avbildning metoder är otillräckliga för att avbilda på dimensioner som ligger mellan penetration gränserna för modern optisk mikroskopi (0,5-1mm) och spridning-begränsades av optiska macroscopy (> 1 cm) [1]. Därför många viktiga modellorganismer, t.ex. insekter, embryon djur eller små extremiteter djur, förblir otillgängliga för in-vivo optisk avbildning.

Även om det ökar intresset för utveckling av nanometer-upplösning optisk avbildning metoder, har det inte varit många lyckade insatser för att förbättra djupet avbildning penetration. Förmågan att utföra in-vivo imaging bortom mikroskopi gränser är i själva verket träffade svårigheterna med foton spridning som finns i vävnader. De senaste ansträngningarna att bilden hela embryon till exempel [2,3] kräver särskild kemisk behandling av provet, för att rensa dem från spridning, en procedur som gör dem lämpliga endast för post mortem-avbildning. Dessa metoder bevis dock behovet av bildhantering större exemplar än de som vanligen tillåts av två-photon eller konfokalmikroskopi, särskilt i utvecklingsbiologi och i läkemedelsutveckling.

Vi har utvecklat en ny optisk bildteknik som heter Mesoskopisk Fluorescens Tomography [4], som är lämpligt för icke-invasiv in vivo imaging på dimensioner av 1mm-5mm. Metoden börser upplösning för penetrationsdjup, men erbjuder oöverträffad tomografiska avbildning prestanda och det har utvecklats för att lägga till tiden som en ny dimension i utvecklingsbiologi observationer (och eventuellt andra områden i biologisk forskning) genom att förmedla förmågan att bilden utvecklingen av fluorescens- taggade svar över tiden. Som sådan kan påskynda studier av morfologiska eller funktionella beroenden på genmutationer eller yttre stimuli, och kan allt, fånga fullständig bild av utvecklingen eller vävnad funktion genom att låta längsgående tidsförlopp visualisering av samma, utveckla organism.

Tekniken använder en modifierad laboratorium mikroskop och multi-projektion belysning för att samla in data vid 360-graders prognoser. Det gäller Fermi förenkling av Fokker-Plank lösning av fotonen transporter ekvationen, kombinerat med geometrisk optik principer för att bygga upp en realistisk inversion som utformats mesoskopisk sortiment. Detta gör att in-vivo hela kroppen visualisering av icke-transparenta tredimensionella strukturer i prover upp till flera millimeter i storlek.

Vi har visat att in vivo-resultat av tekniken genom att avbilda tredimensionella strukturer för utveckling av Drosophila vävnader in-vivo och genom att följa morfogenes av vingarna i ogenomskinliga Drosophila puppor i realtid över sex timmar i följd.

Protocol

Den Drosophila melanogaster lager som används i detta experiment är följande:

• elav-Gal4 (FBti0002575)
• AP-Gal4md544 (FBal0051787)
• UAS-srcEGFP (FBti0013990)
• w1118 (FBal0018186)

För alla experiment var UAS-Gal4 som används för att överuttrycker GFP i vävnaden av intresse (dvs. spottkörtlar eller vingen skivor). Mer specifikt var kvinnor flugor transgena med lämplig Gal4 korsade till UAS-EGFP transgena kompisar. Den korsar föddes upp vid 25 ° C i en fuktig kuvös. När puppor börjar fylla flaskorna (ca 5-6 dagar efter påbörjad korset), de var utvalda för GFP fluorescens vid den vita prepupal stadiet (0-1 tim efter puparium bildning) och samlas in för tomografi avbildning.

1. Inrätta lämpliga kors och bak vid 25 ° C
2. 5-6 dagar efter initiering av korset, välj fluorescerande avkomma för avbildning. Använd en våt pensel för skonsam borttagning av den vita prepupae från sidorna av flaskan.
3. Sätt prepupae i en droppe vatten eller PBS placeras i en petriskål för att ta bort matrester och det kitt som täcker PUPP-fallet och gör provet autofluorescent. Försiktigt rent med en pensel. Om åldrande puppor är nödvändigt, placera utvalda vita prepupae i en petriskål med en våt pappershandduk (en fuktig kammare) eller på sidorna av en ren injektionsflaska med fluga mat. Detta kommer att säkerställa att det finns tillräckligt med fukt, för att möjliggöra lämplig utveckling av djuret.

Drosophila Montering

1. Limma den nedre delen av PUPP-fallet i en kapillär glasrör (800 mikrometer i diameter) så att flugans främre / bakre axeln är orienterad parallellt med röret.
2. Fäst kapillärrör vertikalt på en roterande scen.
3. Justera lutning axel roterande scenen för att den roterande axeln vara parallell med pixel kolumner i bildbehandling CCD.

Fastställande Framåt Modell

1. Fäst en puppa i en kapillär glas och montera som beskrivits tidigare
2. Fyll en kvarts kapillärrör (100 mikrometer, OD) med en fluorescerande färg (Cy5.5)
3. Sätt kapillärrör inuti puppan vid 45 grader i förhållande till främre / bakre axeln
4. Belysa puppan med en excitation laserstråle med låg numerisk bländare objektivet. Samla fluorescens genomlysning bilder över 360 grader roterande puppan längs dess vertikala axel.
5. Montera experimentella data med en lämplig framåt modell

Imaging spottkörtlar

1. Montera en puppa som uttrycker GFP i spottkörtlarna som beskrivits tidigare
2. Lysa med en excitation balk och samla upp i genomlysning GFP fluorescenssignalen över 360 grader roterande puppan längs dess vertikala axel.
3. Rekonstruera den förvärvade uppgifter utnyttja framåt modell

Tidsförlopp Imaging

1. Montera en vit prepupa uttrycka GFP i flygeln imaginal skivor
2. Håll bildmiljö fuktiga och i rumstemperatur för att undvika uttorkning av puppa.
3. Placera en slutartid för att undvika kontinuerlig belysning
4. Lysa med en excitation balk och samla upp i genomlysning GFP fluorescenssignalen över 360 grader roterande puppan längs dess vertikala axel.
5. Rekonstruera den förvärvade uppgifter utnyttja framåt modell.

Histologi

1. Dissekera spottkörtlar CNS / skivor ögat i 1x PBS.
2. Fix vävnad i 4% formaldehyd, 1x PEM (100mm Rör, 1mm EGTA, 1mm MgCl ₂₎ för 20min vid rumstemperatur.
3. Ta bort fixering och montera i Vectashield med Dapi (vektor)
4. Bild med ett fluorescerande mikroskop.

Tidsförlopp histologi

1. Samla vit prepupae och stadium dem i en fuktig kammare.
2. Samla puppor i olika utvecklingsstadier
3. Nagga PUPP-fallet två gånger (0 timmar efter Puparium Formation) med en fin nål (insekt pin 000, FST) innan fixeringen.
4. Fix puppor i 8% formaldehyd, 1x PEM i 6-8 timmar i rumstemperatur under försiktig omrörning.
5. Efter borttagning av fixering och sköljning med 1x PBS, skär den fasta puppan med en vass kniv i två bitar vinkelrätt mot A / P-axeln;
6. Sänk ner två bitar i Vectashield med Dapi (vektor) och montera på coverglass diabilder (Lab-Tek) för avbildning.
7. Hämta bilder med en fluorescens konfokalmikroskop.

Figur 1. Vänligen klicka här för att se alarger version av figur 1.

Discussion

In vivo rekonstruktioner av PUPP-fallet och GFP-uttryckande spottkörtlarna av D. melanogaster prepupa (Skala bar, 500 mikron) med motsvarande histologi (blå, Dapi färgning, grönt, GFP fluorescens) visas i figur 1 (ett). Time-lapse serien avbildning av D. melanogaster vinge imaginal skivor visas i Fig.1 (B). Bilderna förvärvas från en enda levande exemplar, vid fyra olika tidpunkter (0,3.0, 3.5, och 6,5 timmar). I den första kolumnen en projektion vid 0 grader med avseende på puppan är ryggens uppfattning visas. I den andra kolumnen i rekonstruktioner motsvarar de delar som anges med de röda linjerna. Slutligen är en jämförelse med histologi visas den tredje kolumnen. Det är tydligt att histologiska preparat korrelerar väl med tomografiska rekonstruktioner. I (c) plana bilden av en Drosophila är PUPP-fall och GFP-uttryckande spottkörtlar.