Summary
介观荧光断层超越组织切片荧光显微镜渗透限制。该技术是基于多投影照明和光子运输说明。我们表现出体内的形态发生全身三维可视化的GFP表达翼成虫光盘
Abstract
可视化发展的器官的形成以及progession和治疗疾病，往往在很大程度上依赖于光学询问完整的生物体中的分子和功能的变化的能力。大多数现有的光学成像方法，在尺寸之间的渗透现代光学显微镜的限制（0.5 - 1MM）和光肉眼扩散强加的限制在于成像不足（> 1cm）发布[1]。因此，许多重要的模式生物，如昆虫，动物胚胎或小动物的四肢，保持体内的光学成像访问。
虽然有越来越多的对纳米分辨率的光学成像方法的发展利益，再也没有出现过许多成功的努力，在提高成像的穿透深度。执行超出显微镜的限制，在活体成像的能力，其实是在会见与组织中的光子散射目前相关困难。最近作出的努力，例如整个胚胎图像[2,3]，需要特殊化学处理的标本，以清除它们从散射，一个程序，使它们只适合验尸报告成像。然而，这些方法的证据成像大于通常由双光子或共聚焦显微镜，尤其是在发育生物学和药物发现，允许的标本的需要。
我们已经开发出一种新的光学名为介观荧光断层成像技术[4]，适用于尺寸在1mm - 5mm的非侵入体内成像。穿透深度的方法，交流决议，但提供了前所未有的层析成像性能，它已经开发添加为一个新的层面发育生物学观测（和其他可能的生物研究领域）传授的能力，形象演变荧光随着时间的推移标签响应。 ，因此，它可以加速的形态或功能上的基因突变或外部刺激的依赖关系的研究，重要的是，捕捉发展或组织的功能，让相同，发展的有机体的纵向时间推移可视的完整图片。
该技术采用了修改后的实验室显微镜和多投影照明在360度的预测数据收集。它适用于费米简化福克 - 普兰克光子输运方程的解，几何光学的原则结合起来，以建立一个现实的反转计划，适用于介观范围。这使得在体内样本中的非透明的三维结构可视化全身高达几个毫米大小。
我们已经证明了三维成像三个体内的技术性能发展果蝇体内和实时连续超过6小时以下的翅膀在不透明的果蝇蛹的形态发生的组织结构。
Protocol
果蝇在本实验中使用的股票有以下几种：
- elav GAL4（FBti0002575）
- AP - Gal4md544（FBal0051787）
- 无人机srcEGFP（FBti0013990）
- w1118（FBal0018186）
所有实验的UAS - GAL4系统是用于高表达绿色荧光蛋白在利益的组织（即唾液腺或机翼光盘）。更具体地说，与适当的Gal4的转基因的雌性果蝇杂交UAS - EGFP转基因队友。十字架被饲养在25 ° C，在培养箱。当蛹开始填充瓶（约5-6天，后交叉），他们选择了绿色荧光的白色prepupal阶段puparium形成后（0-1小时）和断层成像收集。
- 设置适当的十字架和后方，在25 ° C
- 5-6天后开始交叉，选择荧光成像的后代。使用湿画笔轻柔去除白色小瓶双方prepupae。
- 将水或PBS下降prepupae放置在培养皿中，去除食物颗粒和胶水，涵盖了蛹的情况下，使试样autofluorescent。轻轻地用画笔干净。如果蛹的老龄化是必要的，地点选定在培养皿用湿纸巾（湿热试验箱），或在飞的食物与干净的小瓶双方白色prepupae。这将确保有足够的湿度，使动物的正常发展。
果蝇安装
- 胶底部蛹成毛细玻璃管（直径800微米）的情况下，果蝇的前/后的轴方向平行管。
- 修复毛细管垂直旋转舞台上。
- 调整为旋转轴平行的成像CCD的像素列的倾斜轴旋转舞台。
测定转发模型
- 固定在玻璃毛细管蛹和装入如前所述
- 用荧光染料（Cy5.5），填写一个石英毛细管（100微米，外径）
- 在45度插入毛细管蛹内与前/后轴
- 低数值孔径镜头激发激光束照射的蛹。收集超过360度，沿垂直轴旋转的蛹的荧光透射图像。
- 适合与一个适当的前瞻性模型实验数据
涎腺成像
- 安装在前面所述的唾液腺蛹表达GFP
- 激发光照亮和透收集超过360度，沿垂直轴旋转的蛹的绿色荧光信号。
- 重建采集到的数据，利用正向模型
时移成像
- 安装在机翼成虫光盘白色prepupa表达GFP
- 保持成像环境潮湿，并在室温下，以避免脱水蛹。
- 放置一个快门，以避免连续照明
- 激发光照亮和透收集超过360度，沿垂直轴旋转的蛹的绿色荧光信号。
- 利用远期模型重建所取得的数据。
组织学
- 解剖唾液腺CNS 1X PBS /眼光盘。
- 在4％甲醛，1个质子交换膜（100mm的管道，为1mM EGTA，1MM氯化镁2）在室温下20分钟的修复组织。
- 取出固定在Vectashield用DAPI（矢量）和挂载
- 用荧光显微镜下的图像。
时间的推移组织学
- 收集白色prepupae和他们在湿热试验箱阶段。
- 收集在不同发育阶段的蛹
- 扎蛹的情况下，两次（0小时后Puparium形成），用细针（昆虫针000，FST）的前固定。
- 固定在8％的甲醛，1个质子交换膜在室温下6-8小时，轻轻摇动的蛹。
- 后拆除固定和1X PBS漂洗，切用锋利的刀片在两块固定的蛹垂直的A / P轴;
- 浸Vectashield的两件用DAPI（矢量）和mount玻璃罩幻灯片成像（实验室TEK）。
- 用荧光共聚焦显微镜采集图像。
图1，请点击这里见人图1 arger版本。
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Discussion
蛹的情况下，表达GFP的唾液腺了D在体内重建果蝇 prepupa（比例尺，500微米）与相应的组织学（蓝色，DAPI染色，绿色，绿色荧光）如图1所示（A）。时间推移D 的系列成像果蝇翅膀成虫光盘是在图1（b）所示。图像采集从单一的活标本，在四个不同的时间点（0,3.0，3.5，6.5小时）。在第一列在0度蛹的背视图的投影显示。在第二列的重建对应的红色线条表示的部分。最后，与组织学的比较，显示第三列。显然，组织学的筹备工作以及相关的断层重建。 （三）平面形象的一个果蝇蛹的情况下，表达GFP的唾液腺。
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Acknowledgments
C. Vinegoni承认由美国国立卫生研究院（NIH）拨款1 RO1 - EB006432研究院的支持。
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
