Summary
メゾスコピック蛍光トモグラフィは、組織切片の蛍光顕微鏡の浸透の制限を越えて動作します。技術は、マルチプロジェクション照明と光子輸送記述に基づいています。我々は、生体内でのGFP発現翼成虫ディスクの形態形成の全身3次元可視化を実証
Abstract
開発器官形成だけでなく、病気のprogessionと治療を可視化することは、しばしば大きく光学的に無傷の生体内の分子および機能的変化を調べるために能力に依存しています。ほとんどの既存の光イメージング法は、現代の光学顕微鏡の浸透の制限（0.5〜1mm）および光学肉眼検査の普及に課したの範囲の間にある次元のイメージングには不十分である（> 1CM）[1]。従って、多くの重要なモデル生物、例えば昆虫、動物の胚または小動物の四肢は、生体内光学イメージングのためのアクセス不能のまま。
ナノメートル分解能の光学的イメージング法の開発に向けて関心が高まっているものの、イメージング侵入深さの改善に多くの成功の努力がなされていない。顕微鏡の限界を越えて生体内イメージングを実行する能力は、組織に存在する光子散乱に伴う困難と会ったという事実にあります。たとえば、画像全体の胚への最近の取り組み[2,3]は、散乱からのみ事後イメージングに適し作成する検査法を、それらをクリアするには、標本の特殊化学処理を必要とする。これらのメソッドは、しかし、特に発生生物学や創薬で、通常は二光子または共焦点顕微鏡で許可されているものより画像大きい標本の必要性を証拠。
我々は、メゾスコピック蛍光トモグラフィーという名前の新しい光学的イメージング技術を開発した[4]、1mmの5mmの大きさで、非侵襲的な生体内イメージングに適している。メソッドの交換の侵入深さの解像度が、前例のない断層像性能を提供し、それが画像の蛍光進化する能力を付与することにより発生生物学の観測（そしておそらく生物学的研究の他の地域）における新たな次元として時間を追加するために開発されている時間をかけて応答をタグ付け。そのようなものですから、遺伝子の突然変異または外部からの刺激に対する形態学的または機能的な依存関係の研究を加速することができ、重要なのは、同じ、開発生物の長手方向の経時的可視化を可能にすることにより、開発や組織機能の全体像をキャプチャすることができます。
技術は360度の投影でデータを収集するように変更実験室の顕微鏡とマルチプロジェクション照明を利用しています。それは、メゾスコピック範囲に適した現実的な反転のスキームを構築するために幾何光学の原理と組み合わせ光子輸送方程式のフォッカープランク液にフェルミの簡素化を適用します。これは、最大サイズは数mmまでの試料での非透過的な三次元構造の全身の可視化、生体内で可能です。
我々は、生体内で、6時間連続して上でリアルタイムに不透明なショウジョウバエ蛹の翼の形態形成に従うことによってショウジョウバエの組織を開発するの画像三次元構造により、技術の生体内の性能を実証している。
Protocol
この実験で使用されているキイロショウジョウバエの株式は、次のとおりです。
- elav - GAL4（FBti0002575）
- AP - Gal4md544（FBal0051787）
- UAS - srcEGFP（FBti0013990）
- w1118（FBal0018186）
すべての実験のために、UAS - Gal4のシステムは、目的の組織（すなわち、唾液腺やウィングディスク）にGFPを過剰発現するために使用された。具体的には、適切なGal4のトランスジェニック雌のショウジョウバエは、UAS - EGFPトランスジェニック仲間に交配した。十字架は、加湿インキュベーターで25℃で飼育した。蛹は、バイアルを（クロスの開始後約5-6日）の移入を開始するとき、彼らは白い蛹になる前の段階（蛹殻の形成後に0〜1時間）でGFP蛍光のために選択し、断層イメージングのために収集された。
- 25℃で適切な十字架とリアを設定します° C
- 5-6日クロスの開始後、イメージングのための蛍光子孫を選択します。バイアルの側面から白いprepupaeの穏やかな除去のためのウェット絵筆を使用してください。
- 食品の粒子や蛹のケースをカバーし、試料の自家蛍光なる接着剤を除去するために、ペトリ皿に入れ、水またはPBSのドロップでprepupaeを置く。絵筆で優しくきれい。蛹のエージングが必要な場合、場所はぬれたペーパータオル（湿度の高いチャンバー）とやフライの食べ物ときれいな瓶の側面のペトリ皿に白いprepupaeを選択。これは、動物の適正な発展を可能にするために、十分な湿度があることを保証します。
ショウジョウバエ取り付け
- 接着剤キャピラリーガラス管（800ミクロンの直径）フライの前方/後方の軸がチューブに平行に配向しているように、蛹のケースの底部分。
- 回転ステージ上に垂直にキャピラリーチューブを修正。
- イメージングCCDのピクセル列に平行に回転軸の順番で回転ステージの傾斜軸を調整します。
決定フォワードモデル
- ガラスキャピラリーで蛹を修正し、前に説明したようにマウントします。
- 蛍光色素（Cy5.5）とシリカキャピラリーチューブ（100ミクロン、OD）を埋める
- 前部/後部軸に対して45度で蛹内部毛細管を挿入
- 低開口数のレンズを持つ励起レーザービームで蛹を照らす。その垂直軸に沿ってさなぎを回転360度以上の蛍光透視画像を収集する。
- 適切なフォワードモデルと実験データをフィットする
イメージング唾液腺
- 前に説明したように唾液腺のサナギに表現するGFPをマウントします。
- 励起光を照らすと透視でその垂直軸に沿ってさなぎを回転360度以上のGFPの蛍光信号を収集する。
- フォワードモデルを利用して取得したデータを再構築
タイムラプスイメージング
- 翼成虫ディスクに白い前蛹期に発現GFPをマウントします。
- 蛹の脱水を避けるために、撮影環境は蒸し暑く、室温で保管してください。
- 連続的な照明を避けるためにシャッターを配置
- 励起光を照らすと透視でその垂直軸に沿ってさなぎを回転360度以上のGFPの蛍光信号を収集する。
- フォワードモデルを利用して取得したデータを再構築。
組織学
- 1X PBSで唾液腺CNS /目のディスクを解剖。
- 4％のホルムアルデヒド、室温で20分のための1X PEM（100mMのパイプ、1mMのEGTA、1mMのMgCl 2の ）で組織を固定してください。
- DAPIでVectashieldで固定し、マウントを外します（ベクトル）
- 蛍光顕微鏡による画像。
タイムラプス組織学
- 白いprepupaeを収集し、湿度の高い室でそれらをステージング。
- 異なる発達段階で蛹を集める
- 固定前に細い針（虫ピン000、FST）で2回刺す蛹のケースを（蛹殻形成後0時間）。
- 8％のホルムアルデヒド、穏やかに撹拌しながら室温で6〜8時間のための1X PEMのサナギを修正。
- 固定の除去と1 × PBSで洗浄は、2つの部分に鋭い刃と固定さなぎをカットした後/ Pの軸に垂直な;
- 水没イメージングのためのカバーガラスをスライド上にDAPI（ベクトル）とマウントとVectashieldの2つの部分（ラボテック）。
- 蛍光共焦点顕微鏡で画像を取得する。
図1：してくださいここをクリックしてアルを参照して図1のargerのバージョン。
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Discussion
蛹のケースとGFP発現D.の唾液腺をの生体内再構成対応する組織学（青、DAPI染色、緑、GFP蛍光）とキイロ前蛹（スケールバー、500ミクロン）を図1（a）に示されています。 D.のタイムラプスシリーズイメージングキイロ翼成虫ディスクは、図1（b）に示されています。画像は、4つの異なる時点（0,3.0、3.5、および6.5時間）で、単一のライブ試料から取得されています。最初の列でさなぎの背ビューに対して0度で1投影が表示されます。番目の列で再構成は赤線で示されたセクションに対応しています。最後に、組織との比較は、番目の列に示されている。明らかに、組織学的製剤には断層の再構成とよく相関する。 ショウジョウバエの蛹のケースとGFP発現唾液腺の（c）は平面の画像で。
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Acknowledgments
C. Vinegoniは衛生研究所（NIH）助成1 - RO1 - EB006432の国立研究所からの支援を認めている。
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
