Summary
Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales en
Abstract
Visualizar el desarrollo de la formación de órganos, así como progresión de la enfermedad y el tratamiento a menudo depende en gran medida la capacidad de interrogar ópticamente cambios moleculares y funcionales en los organismos vivos intactos. La mayoría de los métodos ópticos actuales imágenes son inadecuadas para las imágenes en las dimensiones que se encuentran entre los límites de la penetración de la microscopía óptica moderna (0,5-1mm) y los límites impuestos por difusión de macroscopía óptica (> 1 cm) [1]. Por lo tanto, muchos organismos modelo importantes, por ejemplo, los insectos, embriones de animales o en las extremidades de animales pequeños, siguen siendo inaccesibles para los in-vivo de imágenes ópticas.
Aunque hay un creciente interés hacia el desarrollo de métodos de resolución de nanómetros de imagen óptica, no ha habido muchos esfuerzos exitosos en el mejoramiento de la profundidad de penetración de imágenes. La capacidad de realizar en vivo de imágenes de microscopía allá de los límites es, de hecho, se reunió con las dificultades asociadas con la dispersión de fotones presentes en los tejidos. Los recientes esfuerzos para embriones toda la imagen, por ejemplo, [2,3] requieren un tratamiento químico especial de la muestra, para borrar de la dispersión, un procedimiento que hace que sean adecuadas sólo para la post-mortem de imágenes. Estos métodos sin embargo la evidencia la necesidad de que las muestras de imágenes más grandes que los que habitualmente se permite el microscopio de dos fotones o confocal, sobre todo en la biología del desarrollo y de descubrimiento de fármacos.
Hemos desarrollado una nueva técnica de imagen óptica llamada tomografía de fluorescencia mesoscópicas [4], que apropiado para no invasiva en vivo de imágenes en dimensiones de 1 mm a 5 mm. La resolución del método de intercambios para la profundidad de la penetración, pero ofrece un rendimiento de imagen sin precedentes, tomografía y se ha desarrollado para añadir el tiempo como una nueva dimensión en las observaciones de la biología del desarrollo (y posiblemente otras áreas de la investigación biológica), impartiendo la capacidad de la imagen de la evolución de la fluorescencia etiquetados respuestas a través del tiempo. Como tal, puede acelerar los estudios de las dependencias morfológicos o funcionales de las mutaciones del gen o los estímulos externos, y lo más importante puede capturar la imagen completa del desarrollo o la función del tejido, permitiendo longitudinal lapso de tiempo de visualización del mismo organismo, en desarrollo.
La técnica utiliza un microscopio de laboratorio modificados y multi-proyección de la iluminación para recoger datos en las proyecciones de 360 grados. Se aplica la simplificación de Fermi a la solución de Fokker-Planck de la ecuación de transporte de fotones, en combinación con los principios de la óptica geométrica con el fin de construir un plan de inversión realista adecuada para el rango mesoscópico. Esto permite a los in-vivo de todo el cuerpo de visualización de la falta de transparencia de estructuras tridimensionales en las muestras de hasta varios milímetros de tamaño.
Hemos demostrado la actuación en vivo de la técnica por imágenes en tres dimensiones de estructuras de desarrollo de los tejidos de Drosophila en vivo y después de la morfogénesis de las alas en la Drosophila pupas opaco en tiempo real de más de seis horas consecutivas.
Protocol
Las poblaciones de Drosophila melanogaster utilizados en este experimento son los siguientes:
- elav-Gal4 (FBti0002575)
- AP-Gal4md544 (FBal0051787)
- UAS-srcEGFP (FBti0013990)
- w1118 (FBal0018186)
Para todos los experimentos, el sistema UAS-Gal4 se utilizó para sobreexpresar las buenas prácticas agrarias en el tejido de interés (es decir, las glándulas salivares o los discos del ala). Más específicamente, las moscas hembras transgénicas con la adecuada Gal4 fueron cruzadas a UAS-EGFP compañeros de transgénicos. Las cruces fueron criados a 25 ° C en un incubador humidificado. Cuando las pupas de comenzar a llenar los viales (aproximadamente 5-6 días después del inicio de la cruz), que fueron seleccionados para la fluorescencia de GFP en la etapa de blanco prepupal (0-1 horas después de la formación pupa) y recogidos por tomografía.
- Establecer cruzamientos apropiados y posterior a 25 ° C
- 5-6 días después del inicio de la cruz, seleccione la progenie fluorescentes para imágenes. Utilice una brocha húmeda para la eliminación suave de la prepupas blancos desde los laterales del vial.
- Ponga prepupas en una gota de agua o PBS coloca en una placa de Petri para eliminar las partículas de alimentos y el pegamento que se refiere al caso de pupa y hace que la muestra autofluorescentes. Limpie suavemente con un pincel. Si el envejecimiento de las pupas es necesario, lugar elegido prepupas blanco en una placa de Petri con una toalla de papel húmeda (una cámara húmeda) o en los lados de una cubeta limpia con la comida volar. Esto asegurará que no hay suficiente humedad, para permitir el desarrollo adecuado de los animales.
Drosophila montaje
- Pegue la parte inferior de la caja de pupa en un tubo capilar de vidrio (800 micras de diámetro) de tal manera que la mosca anterior / posterior del eje se orienta paralelo al tubo.
- Fijar el tubo capilar verticalmente en un escenario de rotación.
- Ajuste el eje de inclinación de la fase de rotación para que el eje de rotación de modo que sea paralelo a las columnas de píxeles de la imagen CCD.
Determinación adelante Modelo
- Fijar una pupa en un vaso capilar y montaje como se describió anteriormente
- Llenar un tubo capilar de sílice (100 micrones, OD) con un tinte fluorescente (Cy5.5)
- Inserte el tubo capilar dentro de la pupa a 45 grados con respecto al eje anterior / posterior
- Iluminar la pupa con un haz de láser de excitación con una lente de apertura numérica baja. Recoge imágenes de fluorescencia transiluminación más de 360 grados de rotación de la pupa a lo largo de su eje vertical.
- Ajustar los datos experimentales con un modelo apropiado hacia adelante
Imágenes de las glándulas salivales
- Montar una pupa expresar GFP en las glándulas salivales como se describió anteriormente
- Iluminar con un haz de excitación y se acumulan en la transiluminación la señal de fluorescencia de GFP en 360 grados de rotación de la pupa a lo largo de su eje vertical.
- Reconstruir los datos obtenidos utilizando el modelo de avance
Time-lapse de imágenes
- Montar un blanco GFP prepupa expresar en el disco imaginal de ala
- Mantener el ambiente húmedo y de imagen a temperatura ambiente para evitar la deshidratación de la pupa.
- Coloque una velocidad de obturación para evitar la iluminación continua
- Iluminar con un haz de excitación y se acumulan en la transiluminación la señal de fluorescencia de GFP en 360 grados de rotación de la pupa a lo largo de su eje vertical.
- Reconstruir los datos obtenidos utilizando el modelo a seguir.
Histología
- Diseccionar las glándulas salivales del SNC / discos ojo en 1x PBS.
- Para reparar tejidos en formol al 4%, 1x PEM (tuberías de 100 mm, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl 2) de 20 minutos a temperatura ambiente.
- Quitar la fijación y montaje en Vectashield con DAPI (Vector)
- Imagen con un microscopio de fluorescencia.
Time-Lapse Histología
- Recoger prepupas blanca y la que en una cámara húmeda.
- Recoger las pupas en las distintas fases
- Pinchazo de la envoltura pupal dos veces (0 horas después de la formación pupario) con una aguja fina (insectos pin 000, FST) antes de la fijación.
- Fix pupas en el 8% de formaldehído, 1x PEM por 6-8 horas a temperatura ambiente con agitación suave.
- Después de la eliminación de la fijación y enjuague con PBS 1x, cortar la pupa fija con una cuchilla de dos piezas perpendiculares al eje A / P;
- Sumergir las dos piezas en Vectashield con DAPI (Vector) y montaje en portaobjetos cubreobjetos (Lab-Tek) para imágenes.
- Adquirir imágenes con un microscopio confocal de fluorescencia.
Figura 1. Por favor, haga clic aquí para ver alArger versión de la figura 1.
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Discussion
En vivo-reconstrucciones de la envoltura pupal y las glándulas salivales que expresan GFP-de una D. melanogaster prepupa (Barra de escala, de 500 micras) con la histología correspondiente (azul, DAPI, de color verde, la fluorescencia de GFP) se muestra en la Fig. 1 (a). Time-lapse serie de imágenes de D. melanogaster ala discos imaginales se muestra en la Fig. 1 (b). Las imágenes se adquieren a partir de un espécimen vivo sola, en cuatro diferentes puntos de tiempo (0,3.0, 3.5 y 6.5 horas). En la primera columna de una proyección a 0 grados con respecto a la vista dorsal de la pupa se muestra. En la segunda columna las reconstrucciones corresponden a las secciones indicadas por las líneas rojas. Por último, una comparación con la histología se muestra la tercera columna. Claramente, las preparaciones histológicas se correlacionan bien con la reconstrucción tomográfica. En (c) la imagen plana de un caso pupal de Drosophila y de las glándulas salivales que expresan GFP.
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Acknowledgments
C. Vinegoni reconoce el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención 1-SR1-EB006432.
References
- Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).
