Summary
Karyotyping 널리 유전 변경을 검출에 사용되는 간단하고 유용한 기술입니다. 우리가 문화의 유지 이러한 세포의 염색체 상태를 감시하기위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 보급 준비 단계 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다.
Abstract
인간 배아 줄기 세포 (hESC) 안정 diploid의 핵형 1 현재까지 표시되어 있지만, 많은 연구가 문화 조건에 따라 그러한 전체의 추가 또는 염색체의 일부로 염색체 이상이 취득하는 경향이 될 것으로보고있다. 효소 또는 화학적 분리가 2,3,4를 사용하는 경우 passaging에 대한 식민지의 수동 절개는 안정적인 핵형 5 유지하면서 실제로 장기적인 문화 중, karyotypic 변경이 관찰됩니다. 게다가, 피더 세포의 제거 등 환경의 변화는 hESC 3,6의 유전자 무결성을 손상하는 것 같습니다. 일단 염색체 변경은 중요한 고려 hESC는 embryogenesis 연구 및 약물 검사에 필수적인 도구로, 체외에서 hESC의 유전자 무결성의 특성을 세포 생리입니다 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 미래의 치료 목적으로 염색체 변화는 그것이 자주 carcinogenesis에 관련된로서 정말 걱정입니다.
여기 우리는 G - banding, 물고기, 하늘 CGH 기법 7,8으로 설정 염색체의 후속 분석을 위해 고품질의 염색체 확산을 얻을 수있는 간단하고 유용한 방법을 보여줍니다. 우리는 translocations과 aneuploidies의 모양을 모니터하기 위해 5 구절의 간격으로 정기적으로 염색체 상태를 확인하는 것이 좋습니다
Priscila Britto과 Rafaela Sartore이 종이에 똑같이 기여.
Protocol
장비
- 조직 문화와 보육, 37 ° C, 5 % CO 2
- 원심 분리기
- micropipettors (100, 100μL)의 설정
- 워터 목욕 37 ° C
- 물 목욕 90 ° C는 증기 물 원본으로
- 위상 대조 현미경
첫 번째 단계
colcemid와 세포 치료
이 절차에서는 20 %의 녹아웃 혈청 교체 (KSR, Gibco) 및 8ng/mL의 보충과 mitomycin C (시그마)와 inactivated과 DMEM/F12 (Invitrogen)에 마우스 배아 섬유아 세포 유지 (mEF)에 교양 hESC 라인 H9를 사용 fibroblast의 성장 인자 (FGF - 2, R & D).
metaphases의 확산의 큰 숫자를 얻기 위해서는, 그것은 많은 나누어 세포가있는 높은 mitotic 지수와 문화를 사용하는 것이 좋습니다.
- 인큐베이터에서 문화 술병을 가지고 있으며, 층류에서 0,1 μg / ML의 최종 농도에 Colcemid 추가할 수 있습니다.
- 인큐베이터에 술병을 반환하고 억제제가 염색체 잘 응축하고 현미경으로 쉽게 시각 수 metaphase에 mitotic의 체포를 일으킬 수 있도록 3 시간 기다립니다.
세포를 고정
- 매체를 가지고 세포의 표면을 커버하기 위해 tripsin / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.05 %가 충분한 추가할 수 있습니다. 세포가 상온에서 5 분 부화 후 혈청을 포함한 배지를 추가하여 또는 세포에 혈청 추가하여 두 효소를 inactivate 수 있습니다.
참고 : 단일 세포 현탁액이 좋은 metaphase의 확산을 얻는 달성되었는지 확인하는 것이 중요합니다. - 15 ML의 원심 분리기 튜브와 5 분 122g에서 원심 분리기에 세포를 전송합니다.
- 200 ML에 대해 떠나, 표면에 뜨는를 폐기하고, 같은 비디오 같이 튜브를 감청하여 부드럽게 펠렛을 resuspend. 세포가 잘 dissociated되므로,이 솔루션에 대단히 짧은 시간을 시각화 수 있는지 확인하십시오.
- 다음 당신은 hypotonic 솔루션 5 ML (KCl 75mM) 37 미리 예열 ° C, 천천히, 다음 설명에서와 튜브 벽에 의해.를 추가해야합니다 우선 단지 다음 hypotonic 솔루션으로 세포를 섞어 나머지 두 ML을 추가하고 37 보온 ° C를 15 분 동안에 수평 위치로 튜브를 반전, 3 ML를 추가합니다.
참고 :이 시점에서 hypotonic 솔루션은 세포 볼륨에 증가 원인과 염색체를 수습하는 데 도움이 될 것입니다. 부화의 시간은 좋은 염색체 확산을 습득하는 것이 중요합니다. 타이밍이 너무 긴 경우, 세포막 너무 일찍와 염색체가 손실됩니다 버스트 수 있습니다. 너무 짧은 경우, 그것은 세포막이 중단되지 않을 수 있기 때문에 염색체 확산을 얻기 어려울 수 있습니다. - 정착액 용액 (메탄올 / 빙초산 3시 1분) 3 방울을 추가, 쉬지 않고 5 분 122g의 세포 원심과 정착액 솔루션을 섞어 부드럽게 튜브를 반전.
참고 : 정착액 솔루션 갓하여야한다.
참고 : 자료 손실을 방지, 세포의 마찰을 피하기 위해 쉬지 않고 원심 분리를 사용하는 것이 중요합니다. - 200 ML에 대해 떠나, 표면에 뜨는를 폐기하고, 튜브의 바닥을 감청하여 부드럽게 펠렛을 resuspend.
참고 : 다시 세포가 잘 dissociated되므로,이 솔루션에 대단히 짧은 시간을 시각화 수 있는지 확인하십시오. - 당신이 튜브를 회전하는 동안, 튜브 벽에 의해 천천히, 정착액 솔루션의 처음 3 ML을 추가합니다. 그냥 세포를 섞어 다음 세포를 잡으러 튜브 벽에 의해 고정력있는 솔루션의보다이 ML을 추가하는 수평 위치로 튜브를 반전. 4 ° C 하룻밤에 주식.
참고 : 고정 세포는 4 개월 동안 정착액 용액에 저장할 수 있습니다 ° C. 자신의 부푼 상태에서 세포를 보호하는 외에, 정착액 솔루션은 lipids 및 denatures 단백질을 제거합니다. 이러한 이벤트는 결과로, 염색체 쉽게 전파하게, 세포막이 약해하고.
유리 슬라이드 청소
귀하의 염색체 확산은 슬라이드가 깨끗한지 또는 일부 핵을 잃을 수 있으며 metaphases 있는지 확인하고 시작하기 전에. 어떤 하이브리드화 기술 9 시도하려는 경우이 단계 역시 중요합니다.
- 이곳은 실온에서 최소 3 H에 대한 6M HCL을 포함하는 비커에 슬라이드.
- 이 시간 이후 10 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻으십시오.
- 증류수에있는 슬라이드를 씻어 실온에서 그들이 말리면.
- 이제 슬라이드가 96 % 에탄올에 저장하여 사용할 수 보푸라기가없는 바로 전에 건조하실 수 있습니다.
참고 : 현장 하이브리드화 방법의 경우, 슬라이드가 96 % 에탄올에 2 개 이상의 일간 저장되지 않습니다
두 번째 단계
세포를 세척
- 다음날, 쉬지 않고 5 분 122g에 세포를 원심 분리기.
- D200 ML에 대해 떠나는 뜨는을 iscard. 부드럽게 튜브를 회전하는 동안 튜브 그런 다음 튜브 벽에 의해 천천히, 신선한 정착액 솔루션 5 ML (메탄올 / 빙초산 3시 1분)을 추가 flicking하여 펠렛을 Resuspend. 이 세척 세 세척 총 2 번 이상 단계를 반복합니다.
참고 : 정착액 솔루션 갓하여야한다.
슬라이드를 준비
- 마지막으로 원심 분리 단계에서 (그림 1 참조) 셀 펠렛을 균질하고 슬라이드에 세포의 적절한 밀도를 얻기 위해 솔루션의 충분한 양의 두십시오.
- 아주 가까이 그리고 표면에 평행 피펫을 이동하여 깨끗한 마른 슬라이드에 세포 현탁액의 20-30 μL를 추가합니다. 정착액 솔루션 증발, 슬라이드의 표면은 낟알이됩니다.
- 즉시, 전지가 폭발 원인 30 초 동안 온수 (90 °)의 증기로, 슬라이드를 노출까지 얼굴.
참고 :이 시점에서, 증가 초산 농도에서 발생하는 정착액 솔루션 증발에서 메탄올은, 물과 함께하는가 확산 유전자를 자극. - 농도뿐만 아니라 세포 분포는 (그림 1 참조) 좋은 경우 그냥 확인하고 위상 대조 현미경보세요.
- 이제 슬라이드 G - banding (Giemsa), 생선, 하늘 CGH로 cytogenetics 접근에 의해 염색체의 집합을 확인하는 데 사용할 준비가되었습니다.
중요 힌트
분석에 적절한 metaphase를 어떻게 선택
원형 및 격리 metaphases (그림 2D)을 선택하면 둘 이상의 의해 생성된 염색체의 증가가 함께 혼합하거나 시작 염색체에 의해 생성된 염색체의 손실 확산으로 허위 aneuploidies을 고려하여 피할 수 있습니다. 그래서, 일부 염색체 그들 (그림 2A와 2B)에 의해 숨겨져있을 수 있기 때문에 핵 근처 metaphases을 선택하지 마십시오. 게다가 라운드 metaphases 찾는 및 염색체가 metaphase (그림 2C)에서 분리되었는지 확인합니다.
피더 세포와 hESC의 핵형
피더 세포가 분열 상태 (mitomycin C 또는 방사선에 의해 inactivated)에서되지 않으며 metaphase 인구의 일부가되지 않을 것이기 때문입니다 G - banding과 SKY의 분석을 위해, hESC 문화 피더 세포의 존재가 결과에 영향을주지 않습니다. 그러나, 계면 핵의 물고기 기술의 응용 프로그램에 대한, 그것은 생선 분석 trypsinization하기 전에 수동으로 식민지를 수확하여 피더 세포에서 hESC 인구를 분리하는 것이 좋습니다.
그림 1 : 슬라이드에 적절한 셀 밀도를 어떻게 알아. 10X 목적의 위상 대조 현미경 이미지. (A) 세포 밀도가 너무 높습니다. 화살표가 너무 가까이 핵의 확산 metaphase를 가리 킵니다. (B) 좋은 세포 밀도 슬라이드. 동그라미는 핵이나 기타 metaphases에서 고립 metaphases의 확산을 보여줍니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2 : 어떻게 분석하는 적절한 metaphase을 선택할 수 있습니다. 염색체는 DAPI와 100x 목적에 형광 현미경으로 얻은 이미지를 물들일 수 있습니다. (A) (B) 핵 근처 metaphases (화살표로 표시) (C)을하지 않도록하고 현재 염색체는 (동그라미)로 구분되는 둥근하지 metaphases. (D) 원형 metaphase는 분석이 될 수있는 좋은 metaphase입니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Discussion
염색체 확산의 준비 G - banding과 같은 물고기, 하늘과 CGH와 같은보다 정교한 기술로 일상적 방법으로 배아 줄기 세포의 유전자 상태의 성공적인 분석을 위해 매우 중요한 단계입니다.
이 절차는 세포주기의 길이에 따라 다릅니다 colcemid 부화의 기간을 변화하여 많은 세포 유형에 적용할 수 있습니다. embryoid 시체 (EB)이 시간이 최대 6 시간 수 있지만 배아 줄기 세포의 식민지 위해, 우리는 3 시간 기다립니다.
하나의 셀 솔루션을 얻기 위해서는 잘 떼어 놓다해야합니다 세포 집계 (embryoid 기관 등) 작업의 경우. 이 경우에는 트립신과 기계적 분리 후, 당신은 40μm 나일론 셀 스트레이너 (BD Biosciences)를 이용 할 수 있으며 다음 (절차 항목의 4 단계에서) 절차에 순서를 제공합니다.
여기 절차에서는 그것이 세포 현탁액은 염색체와 유물 결과적으로 생성 확산 과도한을 피하기 위해 슬라이드에 "밀접하게"삭제됩니다 협조할 설명했다.
우리는이 프로토콜은 정기적으로뿐만 아니라 배아 줄기 세포를 처리 실험실이 아닌 다른 줄기 세포의 염색체 불안정 공부에 관심이 다른 수사관에 의해 적용하는 유용하고 간단한 도구입니다 있다고 생각합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| Colcemid Karyo MAX | GIBCO, by Life Technologies | 15212-012 | |
| EDTA | Isofar | 721 | |
| Glacial acetic acid | Isofar | 100 | |
| Methanol | Isofar | 208 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck & Co., Inc. | 104.931.000 | |
| Slide | Bioslide | 7105-1 | |
| Tripsin | Sigma-Aldrich | T4799 |
References
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