Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

Summary

Beschrijven we een nieuwe kwantitatieve lipidomics methode voor het identificeren van een groot aantal soorten lipiden in gist met behulp van survey-scan electrospray ionisatie massa spectrometrie (ESI / MS). Deze methode dan op dit moment beschikbare methoden voor lipide identificatie en kwantificering in de mogelijkheid om verschillende moleculaire vormen van lipiden, gevoeligheid en snelheid op te lossen.

Abstract

Lipiden zijn een van de belangrijkste klassen van biomoleculen en spelen een belangrijke rol membraan dynamiek, energie-opslag, en signalering

Protocol

Materialen en methoden

1. Giststammen en groei-omstandigheden
   De wild-type stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) werd gekweekt in een rijke YEPD medium (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose). Cellen werden gekweekt bij 30 ° C met een rotatie schudden bij 200 rpm in erlenmeyers op een 'fles volume / medium volume "ratio van 5:1.
2. Opslag van gistcellen voor vetextractie
   
   1. Een 50 ml cultuur van cellen werd geoogst door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 5 minuten.
   2. Twee keer gewassen met koud water.
      1. Resuspendeer de pellet in 25 ml ijskoud water
      2. Pellet cellen in centrifuge bij 3000 xg gedurende 5 minuten
   3. Resuspendeer de pellet en transfer naar eppendorfbuisje
   4. Pellet door middel van centrifugeren, 16.000 xg gedurende 2 minuten, verwijder supernatant en bevriezen bij -80 ° C tot gebruik. (We gebruiken een beker van isopropylalcohol bewaard in de -80 vriezer, vloeibare stikstof kan ook gebruikt worden)
3. Reagentia
   Biotech kwaliteit chloroform en methanol zijn van Sigma-Aldrich. Vrije vetzuren en triacylglycerolen werden gekocht bij Larodan (Malmö, Zweden). Verschillende soorten fosfolipiden - waaronder fosfatidylcholine, fosfatidylethanolamine, fosfatidylinositol, fosfatidylserine, fosfatidezuur, en cardiolipins - zijn afkomstig van Avanti Polar Lipide (Alabaster, AL, USA). High-speed glazen centrifuge buisjes met Teflon beklede doppen waren van Fisher.

Vetextractie

Dit is een wijziging van het protocol beschreven door Bligh en Dyer ^8. Alle manipulaties met lipiden gewonnen moet worden gedaan met behulp van glazen pipetten of spuiten, plastics zal een grote achtergrond signaal te maken als ze in contact komen met chloroform. De exacte hoeveelheden zijn niet kritisch, zolang de verhoudingen van de 1:2:0.8 voor chloroform - MeOH - H ₂ O bij stap 3 en 2:2:1.8 voor chloroform - MeOH - H ₂ O bij stap 7 worden bewaard.

1. Resuspendeer bevroren cellen in 1,6 ml ijskoude gedistilleerd H ₂ O.
2. Overdracht 1,6 ml van de celsuspensie tot high-speed glazen centrifuge buizen.
3. Voeg 6 ml chloroform en MeOH (1:2) mix en 0,8 ml van glazen kralen aan de celsuspensie.
4. Vortex de celsuspensie met glazen kralen twee keer gedurende 1 minuut.
5. Voeg 2 ml chloroform toe en meng voorzichtig.
6. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur met af en toe mengen.
7. Voeg 2 ml gedestilleerd H ₂ O en meng voorzichtig.
8. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur met af en toe mengen.
9. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur.
10. Verzamel de gehele vloeibare fase in een nieuwe high-speed glazen centrifugebuis.
11. Voeg 3,2 ml chloroform aan de cel pellets van stap 9.
12. Vortex twee keer gedurende 1 minuut.
13. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur.
14. Voeg de supernatant aan de vloeibare fase van stap 10.
15. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur.
16. Gooi de bovenste (waterige) fase en breng de onderste (organische) fase in een nieuwe high-speed glazen centrifugebuis.
17. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur.
18. Breng de hele supernatans in een glazen flesje en droog onder stikstof.
19. Los van de lipide film in 500 pi chloroform en bewaar bij -20 ° C.

Analyse van de lipiden met behulp van massaspectrometrie

Een voorraad mix van lipiden in chloroform normen moeten van tevoren worden bereid per tabel 1, evenals een voorraad oplossing van MeOH - chloroform (1:1) met 0,1% (v / v) ammoniumhydroxide.

1. Voorafgaand aan de injectie, gecombineerd 10 ul van een monster met 10 ul van de standaard mix van lipiden in tabel 1. In 200μL van 1:1 chloroform: methanol met 0,1% NH ₄ OH.
   • De standaard monster-verhouding kan worden veranderd als dat nodig is.
2. Op te lossen met behulp van lipiden een Micromass Q-TOF 2 massaspectrometer uitgerust met een nano-electrospray source besturingssysteem bij een debiet van 1 pl / min.
   • Exacte instrument parameters zal variëren van instrument naar instrument. Zie tabel 2 voor de instellingen voor een Micromass Q-TOF-2 (Waters, Milford, MA, USA) is uitgerust met een nano-electrospray bron. Hoewel we hebben gebruik gemaakt van de hoge resolutie van een Q-TOF type massaspectrometer, is het niet een dwingende eis.
3. Na overname van de massaspectra zijn gladgestreken, achtergrond afgetrokken en gecentreerd, en dan de piek lijst geëxporteerd naar Excel. De pieken van elke lipide klasse zijn vervolgens genormaliseerd om hun interne standaard. Afhankelijk van de toepassing, kan het noodzakelijk zijn doen uitvoeren van verdere post-processing, zoals deisotoping en deconvolutie.

Tabel 1. Interne lipide normen, de concentraties inde standaard mix, en de MS-modus voor hun analyse.

Lipid klasse	Standaard keten samenstelling	Massa van de standaard	Concentratie (ng / ml)	MS-modus
Fosfatidezuur	14:0 / 14:0	591,40	100	Negatief
Fosfatidylethanolamine	14:0 / 14:0	634,45	200	Negatief
Fosfatidylinositol	N / A	N / A	N / A	Negatief
Fosfatidylserine	14:0 / 14:0	622,37	40	Negatief
Cardiolipine	4x14: 0	619,92	100	Negatief
Vrije vetzuren	19:0	297,28	100	Negatief
Fosfatidylcholine	14:0 / 14:0	650,48	100	Positief
Triacylglycerolen	13:0 / 13:0 / 13:0	698,63	200	Positief

Tabel 2. Instrument instellingen voor een Micromass Q-TOF-2 (Waters, Milford, MA, USA) is uitgerust met een nano-electrospray bron.

	Debiet	Cone spanning	Capillaire spanning	Collision gas
Positieve modus	1μl/min	-28 V	3,0 kv	10
Negatieve modus	1μl/min	30 v	-3,2 Kv	10

Discussion

Deze methode maakt een snelle kwantitatieve beoordeling van de gist lipidome met behulp van direct beschikbaar, goedkope materialen. De methode maakt de identificatie van de meeste lipide soorten die in gistcellen, met uitzondering van diacylglycerolen, ergosterolen en ergosteryl esters, hoewel deze lipiden kunnen worden geïdentificeerd door het vervangen van ammonium hydroxide met lithium hydroxide. De beschreven methode kunnen lipide identificatie en kwantificatie van de concentraties zo laag als ug / ml, met de concentratie lineariteit spreiden over 2 tot 3 orden van grootte (afhankelijk van de lipiden soorten). Hoewel de passende normen voor fosfatidylinositol zijn niet commercieel beschikbaar zijn, kunnen de verschillende moleculaire vormen van deze fosfolipiden worden beoordeeld met behulp van normen voor andere fosfolipide soorten.