Summary
نحن تصف طريقة جديدة lipidomics كمي لتحديد الأنواع الدهنية عديدة في الخميرة باستخدام المسح المسح الشامل التأين مطياف electrospray (ESI / MS). هذا الأسلوب يتجاوز حاليا الأساليب المتاحة لتحديد وتقدير الدهون في القدرة على حل مختلف أشكال الجزيئية من الدهون ، والحساسية ، والسرعة.
Abstract
الدهون هي واحدة من الفئات الكبرى من الجزيئات الحيوية والديناميكية أدوارا الغشاء ، وتخزين الطاقة ، والإشارات
Protocol
المواد والأساليب
- سلالات الخميرة وظروف النمو
كانت تزرع سلالة من النوع البري BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) في المتوسط YEPD الغنية (1 ٪ خلاصة الخميرة ، ببتون 2 ٪ ، السكر بنسبة 2 ٪). والخلايا المستزرعة في 30 درجة مئوية مع الهز التناوب في 200 دورة في الدقيقة في قوارير مخروطي في نسبة "قارورة حجم / متوسطة الحجم" ل05:01. - تخزين خلايا الخميرة لاستخراج الدهن
- وكان حصاد ثقافة 50 مل من الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق.
- غسلها مرتين بالماء البارد.
- Resuspend بيليه في 25 مل من ماء الجليد الباردة
- بيليه الخلايا في جهاز الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق
- Resuspend وبيليه ونقل إلى أنبوب إيبندورف
- بيليه بواسطة الطرد المركزي ، 16000 XG لمدة 2 دقيقة ، وتجميد إزالة طاف في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. (حافظنا استخدام كوب من الكحول الآيزوبروبيل -80 في الثلاجة ، ويمكن أيضا أن يستخدم النيتروجين السائل)
- الكواشف
والكلوروفورم والميثانول الصف التكنولوجيا الحيوية من سيغما الدريخ. تم شراؤها الأحماض الدهنية الحرة وtriacylglycerols من Larodan (مالمو ، السويد). تم الحصول عليها من الدهون أفانتي القطبية (المرمر ، AL ، الولايات المتحدة) -- أنواع مختلفة من الدهون الفوسفاتية -- بما في ذلك فسفاتيديل كولين ، فسفاتيديل إيثانولامين ، فسفاتيديل إينوزيتول ، فسفاتيديل ، وحامض الفسفاتيديك وcardiolipins. وكانت عالية السرعة أنابيب الطرد المركزي الزجاج مع قبعات من تفلون اصطف فيشر.
استخراج الدهن
هذا هو تعديل للبروتوكول والتي وصفها بلاي داير 8. وينبغي أن يتم التلاعب مع جميع الدهون المستخرجة باستخدام ماصات زجاجية أو المحاقن واللدائن سيتم إنشاء إشارة الخلفية كبيرة إذا كانوا يخالطون الكلوروفورم. كميات الدقيق ليست مهمة طالما أن نسب 1:2:0.8 لكلوروفورم -- يتم حفظها H 2 O في الخطوة 7 -- MeOH -- H 2 O في الخطوة (3) وبالنسبة لكلوروفورم 2:2:1.8 -- MeOH.
- Resuspend الخلايا المجمدة في 1.6 مل من الجليد الباردة المقطر O. 2 H
- نقل 1.6 مل من تعليق لخلية عالية السرعة أنابيب الطرد المركزي الزجاج.
- إضافة 6 مل من مزيج (1:2) الكلوروفورم وMeOH و 0.8 مل من الخرز الزجاجي إلى تعليق الخلية.
- وقف دوامة زنزانة مع الخرز الزجاجي مرتين لمدة 1 دقيقة.
- إضافة 2 مل من الكلوروفورم والمزيج بلطف.
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع خلط في بعض الأحيان.
- إضافة 2 مل من H 2 O المقطر ومزيج بلطف.
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع خلط في بعض الأحيان.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة.
- جمع مرحلة بأكملها السائل في جديدة عالية السرعة الزجاج أنبوب الطرد المركزي.
- إضافة 3.2 مل من الكلوروفورم إلى خلية من الكريات الخطوة 9.
- دوامة مرتين لمدة 1 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة طاف في المرحلة السائلة من الخطوة 10.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل العليا (المائي) مرحلة ونقل خفض (العضوية) في المرحلة الجديدة عالية السرعة الزجاج أنبوب الطرد المركزي.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة.
- نقل طاف كله في قارورة زجاجية والجافة تحت النيتروجين.
- حل الفيلم الدهون في 500 ميكرولتر من الكلوروفورم ومخزن في -20 درجة مئوية.
تحليل الدهون بواسطة مطياف الكتلة
وينبغي إعداد مزيج من المعايير المخزون الدهني في الكلوروفورم مسبقا وفقا للجدول رقم 1 ، وكذلك حل سهم MeOH -- كلوروفورم (1:1) بنسبة 0.1 ٪ (V / V) هيدروكسيد الأمونيوم.
- قبل الحقن ، والجمع بين 10 ميكرولتر من عينة مع 10 ميكرولتر من مزيج من الدهون القياسية المنصوص عليها في الجدول رقم 1. في 200μL من كلوروفورم 01:01 : الميثانول بنسبة 0.1 ٪ NH 4 OH.
- يمكن تغيير القياسي لنسبة العينة حسب الحاجة.
- حل الدهون باستخدام Q - TOF Micromass مطياف الكتلة 2 مجهزة التشغيل مصدر نانو electrospray في معدل التدفق من 1 ميكروليتر / دقيقة.
- سوف المعلمات صك بالضبط تختلف من أداة للصك. انظر الجدول رقم 2 للحصول على الإعدادات لMicromass Q - TOF 2 (ووترز ، ميلفورد ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مجهزة مصدر نانو electrospray. على الرغم من أننا قد استفادت من ارتفاع القرار من نوع Q - TOF من مطياف الكتلة ، ليس شرطا الزاميا.
- وبعد اكتساب ممهدة الأطياف الشامل ، والخلفية ، وتركزت تطرح ، ثم قائمة ذروة تصدير إلى Excel. ثم يتم تطبيع القمم من كل فئة على مستوى الدهون الداخلية. اعتمادا على التطبيق ، قد يكون من الضروري القيام إجراء مزيد من مرحلة ما بعد المعالجة مثل deisotoping وdeconvolution.
الجدول 1. المعايير الدهون الداخلية ، على التركيزات فيمزيج القياسية ، ووضع MS لتحليلها.
| الطبقة الشحمية | سلسلة التكوين القياسية | كتلة القياسية | تركيز (ميكروغرام / مل) | MS النمط |
| حمض الفسفاتيديك | 14:0 / 14:0 | 591.40 | 100 | سلبي |
| فسفاتيديل إيثانولامين | 14:0 / 14:0 | 634.45 | 200 | سلبي |
| فسفاتيديل إينوزيتول | N / A | N / A | N / A | سلبي |
| فسفاتيديل | 14:0 / 14:0 | 622.37 | 40 | سلبي |
| كارديوليين | 4x14 : 0 | 619.92 | 100 | سلبي |
| الأحماض الدهنية الحرة | 19:00 | 297.28 | 100 | سلبي |
| فسفاتيديل كولين | 14:0 / 14:0 | 650.48 | 100 | إيجابي |
| Triacylglycerols | 13:0 / 13:0 / 13:0 | 698.63 | 200 | إيجابي |
الجدول 2 ضبط آلات لTOF - Q Micromass 2 (ووترز ، ميلفورد ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مجهزة مصدر نانو electrospray.
| معدل التدفق | مخروط الجهد | الشعرية الجهد | اصطدام الغاز | |
| وضع إيجابي | 1μl/min | ت -28 | 3.0 ك. | 10 |
| النمط السلبي | 1μl/min | ت 30 | -3،2 ك. | 10 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الأسلوب يتيح تقييم سريع الكمي للlipidome باستخدام الخميرة متاحة بسهولة ، ومواد غير مكلفة. الأسلوب يسمح تحديد معظم أنواع الدهون الموجودة في خلايا الخميرة باستثناء diacylglycerols ، واسترات ergosterols ergosteryl ، وإن كان يمكن تحديد هذه الدهون عن طريق استبدال هيدروكسيد الأمونيوم مع هيدروكسيد الليثيوم. وصف الأسلوب يتيح تحديد وتقدير الدهون في تركيزات منخفضة بقدر ميكروغرام / لتر ، مع التركيز الخطي نشر أكثر من 2-3 أوامر من حجم (اعتمادا على نوع الدهن). على الرغم من المعايير المناسبة لفسفاتيديل إينوزيتول غير متوفرة تجاريا ، يمكن تقييم الأشكال المختلفة لهذه الجزيئية فسفوليبيد باستخدام المعايير بالنسبة للأنواع الأخرى فسفوليبيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لتيسييه آلان لتقديم المشورة القيمة والمناقشات ، والدعم التقني. نعترف مركز للتطبيقات البيولوجية للالطيف الكتلي في جامعة كونكورديا للخدمات متميزة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من CIHR NSERC وكندا. فيتامين هو محقق جديد CIHR وكرسي أبحاث جامعة كونكورديا في علم الجينوم ، بيولوجيا الخلية والشيخوخة.
References
- Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
- Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
- Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
- Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
- Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
- Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
- Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
