Summary
Nous décrivons une nouvelle méthode quantitative lipidomique pour identifier les espèces de lipides dans la levure à l'aide de nombreuses enquêtes-scan spectrométrie de masse electrospray ionisation (ESI / MS). Cette méthode dépasse actuellement les méthodes disponibles pour l'identification et la quantification des lipides dans la capacité à résoudre les diverses formes moléculaires de lipides, la sensibilité et la vitesse.
Abstract
Les lipides sont une des principales classes de biomolécules et de jouer des rôles importants dynamique de la membrane, le stockage de l'énergie, et la signalisation
Protocol
Matériel et méthodes
- Les souches de levures et de conditions de croissance
La souche de type sauvage BY4742 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) a été cultivé en milieu riche YEPD (extrait de levure 1%, 2% de peptone, glucose 2%). Les cellules ont été cultivées à 30 ° C avec rotation agitation à 200 rpm dans des erlenmeyers à un "flacon de volume / moyen volume" ratio de 5:1. - Stockage des cellules de levure pour l'extraction des lipides
- Une culture de 50 ml de cellules a été récolté par centrifugation à 3000 xg pendant 5 minutes.
- Lavée deux fois avec de l'eau froide.
- Resuspendre le culot dans 25 ml d'eau glacée
- Cellules Pellet centrifuger à 3000 xg pendant 5 minutes
- Reprendre le culot et le transfert à tube Eppendorf
- Par centrifugation, 16000 xg pendant 2 minutes, retirer le surnageant et congeler à -80 ° C jusqu'à utilisation. (Nous utilisons un bécher d'alcool isopropylique conservés dans le congélateur -80, l'azote liquide peut également être utilisé)
- Réactifs
Biotech grade et le chloroforme méthanol étaient de Sigma-Aldrich. Les acides gras libres et les triglycérides ont été achetés auprès Larodan (Malmö, Suède). Diverses espèces de phospholipides - y compris la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, le phosphatidylinositol, la phosphatidylsérine, l'acide phosphatidique, et cardiolipines - ont été obtenus à partir de lipides polaires Avanti (Alabaster, Alabama, USA). Haute vitesse des tubes à centrifuger en verre avec des bouchons en téflon ont été doublés de Fisher.
L'extraction des lipides
Ceci est une modification du protocole décrit par Bligh et Dyer 8. Toutes les manipulations avec les lipides extraits devrait être fait en utilisant des pipettes en verre ou des seringues, des plastiques va créer un signal de fond de grandes si elles entrent en contact avec du chloroforme. Les volumes exacts ne sont pas critiques pour autant que les ratios de 1:2:0.8 pour le chloroforme - MeOH - H 2 O à l'étape 3 et 2:2:1.8 pour le chloroforme - MeOH - H 2 O à l'étape 7 sont conservés.
- Resuspendre les cellules congelées dans 1,6 ml de glace froide distillée H 2 O.
- Transfert 1,6 ml de la suspension cellulaire à haut débit des tubes à centrifuger en verre.
- Ajouter 6 ml de chloroforme et de MeOH (1:2) mélanger et 0,8 ml de perles de verre à la suspension cellulaire.
- Vortex la suspension cellulaire avec des perles de verre deux fois pendant 1 min.
- Ajouter 2 ml de chloroforme et mélanger délicatement.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante avec mélange occasionnel.
- Ajouter 2 ml de H 2 O distillée et mélanger doucement.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante avec mélange occasionnel.
- Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante.
- Recueillir toute la phase liquide dans un nouveau haut-débit tube à centrifuger en verre.
- Ajouter 3,2 ml de chloroforme pour les culots de cellules de l'étape 9.
- Vortex deux fois pendant 1 min.
- Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante.
- Ajouter le surnageant dans la phase liquide de l'étape 10.
- Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante.
- Jeter la partie supérieure (aqueuse) et le transfert de phase inférieure (phase organique) dans un nouveau haut-débit tube à centrifuger en verre.
- Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante.
- Transférer le surnageant entier dans un flacon en verre et sec sous azote.
- Dissoudre le film lipidique dans 500 ul de chloroforme et de stocker à -20 ° C.
Analyse des lipides par spectrométrie de masse
Un mélange stock de lipides dans le chloroforme normes doivent être préparées à l'avance conformément au tableau 1, ainsi que d'une solution stock de MeOH - chloroforme (1:1) avec 0,1% (v / v) d'hydroxyde d'ammonium.
- Avant l'injection, mélanger 10 ul d'un échantillon de 10 ul du mélange standard de lipides dans le Tableau 1. En 200 pl de 1:1 chloroforme: méthanol avec 0,1% de NH 4 OH.
- La norme ratio de l'échantillon peut être changé dès que nécessaire.
- Résoudre les lipides en utilisant un Micromass Q-TOF 2 spectromètre de masse équipé d'une source d'exploitation de nano-electrospray à un débit de 1 l / min.
- Paramètres de l'instrument exact varie d'un instrument à l'. Voir tableau 2 pour les paramètres d'un Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) équipé d'une source de nano-électrospray. Bien que nous avons pris avantage de la haute résolution d'un type Q-TOF du spectromètre de masse, ce n'est pas une exigence obligatoire.
- Après l'acquisition des spectres de masse sont lissées, fond soustrait et centré, et puis la liste de pointe exportés vers Excel. Les pics de chaque classe de lipides sont ensuite normalisés à leur standard interne. Selon l'application, il peut être nécessaire ne effectuer un post-traitement tels que deisotoping et déconvolution.
Normes le tableau 1. Lipides internes, leurs concentrations dansle mélange standard, et le mode MS pour leur analyse.
| Classe des lipides | Composition de la chaîne standard | Messe de la norme | Concentration (pg / ml) | MS Mode |
| L'acide phosphatidique | 14:0 / 14:0 | 591,40 | 100 | Négative |
| Phosphatidyléthanolamine | 14:0 / 14:0 | 634,45 | 200 | Négative |
| Phosphatidylinositol | N / A | N / A | N / A | Négative |
| Phosphatidylsérine | 14:0 / 14:0 | 622,37 | 40 | Négative |
| Cardiolipine | 4x14: 0 | 619,92 | 100 | Négative |
| Les acides gras libres | 19:00 | 297,28 | 100 | Négative |
| La phosphatidylcholine | 14:0 / 14:0 | 650,48 | 100 | Positive |
| Triacylglycérols | 13:0 / 13:0 / 13:0 | 698,63 | 200 | Positive |
Tableau 2. Paramètres pour un instrument Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) équipé d'une source de nano-électrospray.
| Débit | Tension de cône | Tension capillaire | Gaz de collision | |
| Mode positif | 1μl/min | -28 V | 3,0 kV | 10 |
| Mode négatif | 1μl/min | 30 v | -3,2 KV | 10 |
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Discussion
Cette méthode permet une évaluation quantitative rapide du lipidome levure à l'aide disponible, des matériaux peu coûteux. La méthode permet l'identification de la plupart des espèces de lipides dans les cellules de levure à l'exception de diacylglycérols, ergostérols et esters ergosteryl, bien que ces lipides peuvent être identifiés en remplaçant l'hydroxyde d'ammonium avec de l'hydroxyde de lithium. La méthode décrite permet l'identification et la quantification des lipides à des concentrations aussi faibles que pg / ml, avec la linéarité de concentration qui s'étend sur 2 à 3 ordres de grandeur (selon l'espèce de lipides). Bien que des normes appropriées pour phosphatidylinositol ne sont pas disponibles dans le commerce, les différentes formes moléculaires de ce phospholipide peut être évaluée en utilisant des normes pour les espèces de phospholipides d'autres.
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Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Alain Tessier à titre onéreux conseils, discussions, et le support technique. Nous reconnaissons le Centre pour les applications biologiques de la spectrométrie de masse à l'Université Concordia pour services exceptionnels. Ce travail a été soutenu par des subventions des IRSC et le CRSNG du Canada. VIT est une nouvelle chercheuse des IRSC et président de Concordia recherche universitaire en génomique, biologie cellulaire et le vieillissement.
References
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