Summary
Descrevemos um novo método lipidomics quantitativos para identificação de espécies de lipídios numerosos em levedura utilizando pesquisa scan-espectrometria de massa de ionização electrospray (ESI / MS). Este método ultrapassa atualmente os métodos disponíveis para identificação e quantificação de lipídios na capacidade de resolver diversas formas moleculares de lipídeos, sensibilidade e velocidade.
Abstract
Lipídios são uma das principais classes de biomoléculas e jogar papéis importantes membrana dinâmica, armazenamento de energia, e sinalização
Protocol
Materiais e métodos
- Cepas de leveduras e condições de crescimento
A cepa do tipo selvagem BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) foi cultivado em meio YEPD rica (1% extrato de levedura, peptona 2%, 2% de glicose). Células foram cultivadas a 30 ° C com rotação agitação a 200 rpm em Erlenmeyers em um "volume frasco de volume / médio" proporção de 5:1. - Armazenamento de células de levedura para extração de lipídios
- Uma cultura de 50 ml de células foi colhido por centrifugação a 3000 xg por 5 minutos.
- Lavados duas vezes com água fria.
- Ressuspender pellet em 25 ml de água gelada fria
- Células sedimento em centrífuga a 3000 xg por 5 minutos
- Ressuspender o sedimento e transferir para tubo eppendorf
- Pellet por centrifugação, 16.000 xg por 2 minutos, retire o sobrenadante e congelar a -80 ° C até o uso. (Usamos um copo de álcool isopropílico mantido no freezer -80, nitrogênio líquido também pode ser usado)
- Reagentes
Clorofórmio e metanol grau de biotecnologia foram da Sigma-Aldrich. Ácidos graxos livres e triacilgliceróis foram adquiridos da Larodan (Malmo, Suécia). Várias espécies de fosfolipídios - incluindo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico e cardiolipins - foram obtidos a partir Lipid Avanti Polar (Alabaster, AL, EUA). Alta velocidade de centrifugação de tubos de vidro com tampas de teflon foram de Fisher.
Extração de lipídios
Esta é uma modificação do protocolo descrito por Bligh e Dyer 8. Todas as manipulações com lipídios extraídos deve ser feito usando pipetas de vidro ou seringas; plásticos irá criar um grande sinal de fundo, se eles entram em contato com clorofórmio. Os volumes exatos não são críticas, desde que os rácios de 1:2:0.8 para clorofórmio - MeOH - H 2 O na etapa 3 e 2:2:1.8 para clorofórmio - MeOH - H 2 O na etapa 7 são conservados.
- Ressuspender as células congeladas em 1,6 ml de gelada destilada H 2 O.
- Transferência de 1,6 ml da suspensão de células de alta velocidade tubos de centrífuga de vidro.
- Adicionar 6 ml de clorofórmio e MeOH mistura (1:2) e 0,8 ml de contas de vidro à suspensão de células.
- Vortex da suspensão de células com contas de vidro duas vezes por 1 min.
- Adicionar 2 ml de clorofórmio e misture delicadamente.
- Incubar por 5 min à temperatura ambiente com mistura ocasional.
- Adicionar 2 ml de H 2 O destilada e misture delicadamente.
- Incubar por 5 min à temperatura ambiente com mistura ocasional.
- Centrifugar por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
- Recolher toda a fase líquida em um novo tubo de centrífuga de alta velocidade de vidro.
- Adicionar 3,2 ml de clorofórmio para as pelotas de células a partir do passo 9.
- Vortex duas vezes por 1 min.
- Centrifugar por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
- Adicione o sobrenadante para a fase líquida a partir do passo 10.
- Centrifugar por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
- Descartar a fase (aquosa) superior e transferir a camada inferior (fase orgânica) em um novo tubo de centrífuga de alta velocidade de vidro.
- Centrifugar por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
- Transferir o sobrenadante inteiro em um frasco de vidro e seco sob nitrogênio.
- Dissolver o filme lipídico em 500 mL de clorofórmio e armazenar a -20 ° C.
Análise de lipídios por espectrometria de massa
Um mix de ações de padrões de lipídios em clorofórmio deve ser preparado com antecedência, conforme Tabela 1, bem como uma solução estoque de MeOH - clorofórmio (1:1) com 0,1% (v / v) de hidróxido de amônio.
- Antes da injecção, combine 10 ml de uma amostra com 10 ml da mistura padrão de lipídios na Tabela 1. Em 200μL de 1:1 clorofórmio: metanol com 0,1% NH 4 OH.
- O padrão a proporção da amostra pode ser mudado quando necessário.
- Lipídios resolver usando um Micromass Q-TOF espectrômetro de massa 2 equipado com um operacional de código nano-electrospray a uma vazão de 1 ml / min.
- Parâmetros do instrumento exato vai variar de instrumento para instrumento. Ver Tabela 2 para as configurações de uma Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EUA) equipado com uma fonte de nano-electrospray. Embora tenhamos aproveitado a alta resolução de um tipo Q-TOF de espectrômetro de massa, não é um requisito obrigatório.
- Após a aquisição dos espectros de massa são suavizadas, fundo subtraído e centrado, e então a lista de pico exportados para Excel. Os picos de cada classe de lipídios são então normalizados para o seu padrão interno. Dependendo da aplicação, pode ser necessário fazer executar mais de pós-processamento, tais como deisotoping e deconvolução.
Tabela 1. Lipídica padrões internos, suas concentrações naa mistura padrão, eo modo de MS para sua análise.
| Classe de lipídios | Composição da cadeia padrão | Massa de padrão | Concentração (mg / ml) | MS modo |
| Ácido fosfatídico | 14:0 / 14:0 | 591,40 | 100 | Negativo |
| Fosfatidiletanolamina | 14:0 / 14:0 | 634,45 | 200 | Negativo |
| Fosfatidilinositol | N / A | N / A | N / A | Negativo |
| Fosfatidilserina | 14:0 / 14:0 | 622,37 | 40 | Negativo |
| Cardiolipina | 4x14: 0 | 619,92 | 100 | Negativo |
| Ácidos graxos livres | 19:00 | 297,28 | 100 | Negativo |
| Fosfatidilcolina | 14:0 / 14:0 | 650,48 | 100 | Positivo |
| Triacilgliceróis | 13:0 / 13:0 / 13:0 | 698,63 | 200 | Positivo |
Tabela 2. Definições Instrumento para um Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EUA) equipado com uma fonte de nano-electrospray.
| Taxa de fluxo | Tensão Cone | Tensão capilar | Gás de colisão | |
| Modo positivo | 1μl/min | -28 V | 3,0 kv | 10 |
| Modo negativo | 1μl/min | 30 v | -3,2 Kv | 10 |
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Discussion
Este método permite uma rápida avaliação quantitativa do lipidome levedura utilizando prontamente disponíveis, materiais mais baratos. O método permite a identificação da maioria das espécies de lipídios encontrados em células de levedura com exceção de diacilgliceróis, ergosterols e ésteres ergosteryl, embora estes lipídios podem ser identificados através da substituição de hidróxido de amônio com hidróxido de lítio. O método descrito permite a identificação e quantificação de lipídios nas concentrações tão baixo quanto mcg / ml, com a linearidade concentração espalhando 2-3 ordens de magnitude (dependendo da espécie de lipídios). Embora as normas apropriadas para fosfatidilinositol não estão disponíveis comercialmente, as diferentes formas molecular deste fosfolipídio pode ser avaliado usando padrões para as espécies de fosfolipídios outros.
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Acknowledgments
Somos gratos a Alain Tessier para aconselhar valiosa, discussões e suporte técnico. Reconhecemos o Centro de Aplicações Biológicas de Espectrometria de Massa na Concordia University para os serviços proeminentes. Este trabalho foi financiado por concessões do CIHR e NSERC do Canadá. VIT é um CIHR New Investigator e Concordia University, em Cátedra de Investigação Genómica, Biologia Celular e Envelhecimento.
References
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