Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

doi: 10.3791/1513 Published: August 21, 2009

Summary

Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.

Abstract

Los lípidos son una de las principales clases de biomoléculas y desempeñan funciones importantes en la dinámica de la membrana, el almacenamiento de energía, y la señalización

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Materiales y métodos

  1. Cepas de levadura y las condiciones de crecimiento
    La cepa de tipo salvaje BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) fue cultivada en medio rico en YEPD (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa). Las células fueron cultivadas a 30 ° C con rotación agitación a 200 rpm en frascos de Erlenmeyer en un "frasco de volumen / volumen medio de" proporción de 5:1.
  2. Almacenamiento de las células de levadura para la extracción de lípidos
    1. Un cultivo de 50 ml de células se recogieron por centrifugación a 3000 xg durante 5 minutos.
    2. Lavaron dos veces con agua fría.
      1. Resuspender el pellet en 25 ml de agua con hielo frío
      2. Pellet células de centrifugar a 3000 xg durante 5 minutos
    3. Resuspender el precipitado y traslado al tubo eppendorf
    4. Pellet por centrifugación, 16.000 xg durante 2 minutos, retire el sobrenadante y congelar a -80 ° C hasta su uso. (Se utiliza un vaso de alcohol isopropílico en el congelador -80, nitrógeno líquido también se puede utilizar)
  3. Reactivos
    Cloroformo y metanol grado de biotecnología fueron de Sigma-Aldrich. Los ácidos grasos libres y triglicéridos fueron adquiridos de Larodan (Malmö, Suecia). Varias especies de fosfolípidos - incluyendo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, y cardiolipinas - se obtuvieron a partir de lípidos Avanti Polar (Alabaster, AL, EE.UU.). De alta velocidad tubos de centrífuga de vidrio con tapas de teflón eran de Fisher.

Extracción de lípidos

Esta es una modificación del protocolo descrito por Bligh y Dyer 8. Todas las manipulaciones con lípidos extraídos se debe hacer uso de pipetas de vidrio o las jeringas, los plásticos, se creará una gran señal de fondo, si entran en contacto con cloroformo. Los volúmenes exactos no son críticos, siempre y cuando las razones de 1:2:0.8 de cloroformo - metanol - H 2 O en el paso 3 y 2:2:1.8 de cloroformo - metanol - H 2 O en el paso 7 se conservan.

  1. Resuspender las células congeladas en 1,6 ml de helado destilada H 2 O.
  2. La transferencia de 1,6 ml de la suspensión celular a alta velocidad centrífuga de tubos de vidrio.
  3. Agregar 6 ml de cloroformo y metanol (1:2) y mezclar 0,8 ml de perlas de vidrio a la suspensión celular.
  4. Vortex la suspensión celular con cuentas de vidrio dos veces durante 1 min.
  5. Añadir 2 ml de cloroformo y mezclar suavemente.
  6. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente con mezcla ocasional.
  7. Añadir 2 ml de H 2 O destilada y mezclar suavemente.
  8. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente con mezcla ocasional.
  9. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
  10. Recoger la fase líquida entera en una nueva de alta velocidad tubo de centrífuga de vidrio.
  11. Añadir 3,2 ml de cloroformo a los gránulos de las células desde el paso 9.
  12. Vortex dos veces durante 1 min.
  13. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
  14. Añadir el sobrenadante a la fase líquida a partir del paso 10.
  15. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
  16. Deseche la parte superior (acuosa) y la fase de transferencia de la parte inferior (fase orgánica), en una nueva de alta velocidad tubo de centrífuga de vidrio.
  17. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
  18. Transferir el sobrenadante todo en un frasco de vidrio y en atmósfera de nitrógeno seco.
  19. Disolver la película de lípidos en 500 l de cloroformo y almacenar a -20 ° C.

El análisis de los lípidos por espectrometría de masas

Una mezcla de valores de las normas de lípidos en cloroformo deben estar preparados de antemano según la Tabla 1, así como una solución de metanol - cloroformo (1:1) con el 0,1% (v / v) de hidróxido de amonio.

  1. Antes de la inyección, se combinan 10 l de una muestra con 10 l de la mezcla estándar de los lípidos en la Tabla 1. En 200μL de 1:1 cloroformo: metanol con 0,1% de NH 4 OH.
    • El estándar de proporción de la muestra se puede cambiar según sea necesario.
  2. Resolver los lípidos con un Micromass Q-TOF 2 espectrómetro de masas equipados con un operativo de código nano-electrospray con un caudal de 1 l / min.
    • Parámetros exactos de instrumentos varían de un instrumento a otro. Ver Tabla 2 para la configuración de un Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EE.UU.) equipado con una fuente nano-electrospray. A pesar de que han tomado ventaja de la alta resolución de un tipo Q-TOF de espectrómetro de masas, no es un requisito obligatorio.
  3. Después de la adquisición de los espectros de masas se suavizan, resta fondo y centrado, a continuación, la lista de pico exportados a Excel. Los picos de cada clase de lípidos se normalizan a su estándar interno. Dependiendo de la aplicación, puede ser necesario realice más de post-procesamiento, tales como deisotoping y deconvolución.

Normas de la Tabla 1. Internos de lípidos, su concentración enla mezcla estándar y el modo de MS para su análisis.

Lípidos clase Composición estándar de la cadena La masa del patrón Concentración (mg / ml) MS modo
Ácido fosfatídico 14:0 / 14:0 591,40 100 Negativo
Fosfatidiletanolamina 14:0 / 14:0 634,45 200 Negativo
Fosfatidilinositol N / A N / A N / A Negativo
Fosfatidilserina 14:0 / 14:0 622,37 40 Negativo
Cardiolipina 4x14: 0 619,92 100 Negativo
Los ácidos grasos libres 19:00 297,28 100 Negativo
Fosfatidilcolina 14:0 / 14:0 650,48 100 Positiva
Triacilgliceroles 13:0 / 13:0 / 13:0 698,63 200 Positiva

Tabla 2. Ajuste del equipo para un Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EE.UU.) equipado con una fuente nano-electrospray.

Caudal Cono de tensión Tensión capilar Colisión de gas
Modo positivo 1μl/min -28 V 3.0 kv 10
Modo negativo 1μl/min 30 v -3,2 Kv 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Este método permite una rápida evaluación cuantitativa de la lipidome levadura utilizando fácilmente disponibles, materiales de bajo costo. El método permite la identificación de la mayoría de las especies de lípidos en las células de levadura con la excepción de diacilgliceroles, ergosterols y ésteres ergosteryl, a pesar de estos lípidos pueden ser identificados mediante la sustitución de hidróxido de amonio con hidróxido de litio. El método descrito permite la identificación y cuantificación de los lípidos en las concentraciones tan bajas como mg / ml, con la linealidad de la concentración de la difusión de más de 2 a 3 órdenes de magnitud (en función de las especies de lípidos). Aunque los estándares apropiados para fosfatidilinositol no están disponibles comercialmente, las diferentes formas moleculares de este fosfolípido puede ser evaluado utilizando los estándares para las especies de fosfolípidos otros.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Damos las gracias a Alain Tessier de valiosos consejos, discusiones, y soporte técnico. Reconocemos el Centro de Aplicaciones Biológicas de la Espectrometría de Masas en la Universidad Concordia por servicios distinguidos. Este trabajo fue apoyado por becas de los CIHR y NSERC de Canadá. VIT es un investigador de Nueva CIHR y Concordia Cátedra de Investigación de la Universidad de genómica, biología celular y el envejecimiento.

References

  1. Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
  2. Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
  3. Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
  4. Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
  5. Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
  6. Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
  7. Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
  8. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).More

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter