Summary
Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.
Abstract
Los lípidos son una de las principales clases de biomoléculas y desempeñan funciones importantes en la dinámica de la membrana, el almacenamiento de energía, y la señalización
Protocol
Materiales y métodos
- Cepas de levadura y las condiciones de crecimiento
La cepa de tipo salvaje BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) fue cultivada en medio rico en YEPD (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa). Las células fueron cultivadas a 30 ° C con rotación agitación a 200 rpm en frascos de Erlenmeyer en un "frasco de volumen / volumen medio de" proporción de 5:1. - Almacenamiento de las células de levadura para la extracción de lípidos
- Un cultivo de 50 ml de células se recogieron por centrifugación a 3000 xg durante 5 minutos.
- Lavaron dos veces con agua fría.
- Resuspender el pellet en 25 ml de agua con hielo frío
- Pellet células de centrifugar a 3000 xg durante 5 minutos
- Resuspender el precipitado y traslado al tubo eppendorf
- Pellet por centrifugación, 16.000 xg durante 2 minutos, retire el sobrenadante y congelar a -80 ° C hasta su uso. (Se utiliza un vaso de alcohol isopropílico en el congelador -80, nitrógeno líquido también se puede utilizar)
- Reactivos
Cloroformo y metanol grado de biotecnología fueron de Sigma-Aldrich. Los ácidos grasos libres y triglicéridos fueron adquiridos de Larodan (Malmö, Suecia). Varias especies de fosfolípidos - incluyendo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, y cardiolipinas - se obtuvieron a partir de lípidos Avanti Polar (Alabaster, AL, EE.UU.). De alta velocidad tubos de centrífuga de vidrio con tapas de teflón eran de Fisher.
Extracción de lípidos
Esta es una modificación del protocolo descrito por Bligh y Dyer 8. Todas las manipulaciones con lípidos extraídos se debe hacer uso de pipetas de vidrio o las jeringas, los plásticos, se creará una gran señal de fondo, si entran en contacto con cloroformo. Los volúmenes exactos no son críticos, siempre y cuando las razones de 1:2:0.8 de cloroformo - metanol - H 2 O en el paso 3 y 2:2:1.8 de cloroformo - metanol - H 2 O en el paso 7 se conservan.
- Resuspender las células congeladas en 1,6 ml de helado destilada H 2 O.
- La transferencia de 1,6 ml de la suspensión celular a alta velocidad centrífuga de tubos de vidrio.
- Agregar 6 ml de cloroformo y metanol (1:2) y mezclar 0,8 ml de perlas de vidrio a la suspensión celular.
- Vortex la suspensión celular con cuentas de vidrio dos veces durante 1 min.
- Añadir 2 ml de cloroformo y mezclar suavemente.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente con mezcla ocasional.
- Añadir 2 ml de H 2 O destilada y mezclar suavemente.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente con mezcla ocasional.
- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
- Recoger la fase líquida entera en una nueva de alta velocidad tubo de centrífuga de vidrio.
- Añadir 3,2 ml de cloroformo a los gránulos de las células desde el paso 9.
- Vortex dos veces durante 1 min.
- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
- Añadir el sobrenadante a la fase líquida a partir del paso 10.
- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
- Deseche la parte superior (acuosa) y la fase de transferencia de la parte inferior (fase orgánica), en una nueva de alta velocidad tubo de centrífuga de vidrio.
- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
- Transferir el sobrenadante todo en un frasco de vidrio y en atmósfera de nitrógeno seco.
- Disolver la película de lípidos en 500 l de cloroformo y almacenar a -20 ° C.
El análisis de los lípidos por espectrometría de masas
Una mezcla de valores de las normas de lípidos en cloroformo deben estar preparados de antemano según la Tabla 1, así como una solución de metanol - cloroformo (1:1) con el 0,1% (v / v) de hidróxido de amonio.
- Antes de la inyección, se combinan 10 l de una muestra con 10 l de la mezcla estándar de los lípidos en la Tabla 1. En 200μL de 1:1 cloroformo: metanol con 0,1% de NH 4 OH.
- El estándar de proporción de la muestra se puede cambiar según sea necesario.
- Resolver los lípidos con un Micromass Q-TOF 2 espectrómetro de masas equipados con un operativo de código nano-electrospray con un caudal de 1 l / min.
- Parámetros exactos de instrumentos varían de un instrumento a otro. Ver Tabla 2 para la configuración de un Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EE.UU.) equipado con una fuente nano-electrospray. A pesar de que han tomado ventaja de la alta resolución de un tipo Q-TOF de espectrómetro de masas, no es un requisito obligatorio.
- Después de la adquisición de los espectros de masas se suavizan, resta fondo y centrado, a continuación, la lista de pico exportados a Excel. Los picos de cada clase de lípidos se normalizan a su estándar interno. Dependiendo de la aplicación, puede ser necesario realice más de post-procesamiento, tales como deisotoping y deconvolución.
Normas de la Tabla 1. Internos de lípidos, su concentración enla mezcla estándar y el modo de MS para su análisis.
| Lípidos clase | Composición estándar de la cadena | La masa del patrón | Concentración (mg / ml) | MS modo |
| Ácido fosfatídico | 14:0 / 14:0 | 591,40 | 100 | Negativo |
| Fosfatidiletanolamina | 14:0 / 14:0 | 634,45 | 200 | Negativo |
| Fosfatidilinositol | N / A | N / A | N / A | Negativo |
| Fosfatidilserina | 14:0 / 14:0 | 622,37 | 40 | Negativo |
| Cardiolipina | 4x14: 0 | 619,92 | 100 | Negativo |
| Los ácidos grasos libres | 19:00 | 297,28 | 100 | Negativo |
| Fosfatidilcolina | 14:0 / 14:0 | 650,48 | 100 | Positiva |
| Triacilgliceroles | 13:0 / 13:0 / 13:0 | 698,63 | 200 | Positiva |
Tabla 2. Ajuste del equipo para un Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EE.UU.) equipado con una fuente nano-electrospray.
| Caudal | Cono de tensión | Tensión capilar | Colisión de gas | |
| Modo positivo | 1μl/min | -28 V | 3.0 kv | 10 |
| Modo negativo | 1μl/min | 30 v | -3,2 Kv | 10 |
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Discussion
Este método permite una rápida evaluación cuantitativa de la lipidome levadura utilizando fácilmente disponibles, materiales de bajo costo. El método permite la identificación de la mayoría de las especies de lípidos en las células de levadura con la excepción de diacilgliceroles, ergosterols y ésteres ergosteryl, a pesar de estos lípidos pueden ser identificados mediante la sustitución de hidróxido de amonio con hidróxido de litio. El método descrito permite la identificación y cuantificación de los lípidos en las concentraciones tan bajas como mg / ml, con la linealidad de la concentración de la difusión de más de 2 a 3 órdenes de magnitud (en función de las especies de lípidos). Aunque los estándares apropiados para fosfatidilinositol no están disponibles comercialmente, las diferentes formas moleculares de este fosfolípido puede ser evaluado utilizando los estándares para las especies de fosfolípidos otros.
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Acknowledgments
Damos las gracias a Alain Tessier de valiosos consejos, discusiones, y soporte técnico. Reconocemos el Centro de Aplicaciones Biológicas de la Espectrometría de Masas en la Universidad Concordia por servicios distinguidos. Este trabajo fue apoyado por becas de los CIHR y NSERC de Canadá. VIT es un investigador de Nueva CIHR y Concordia Cátedra de Investigación de la Universidad de genómica, biología celular y el envejecimiento.
References
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