Summary
Biz maya kullanarak anket-tarama elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI / MS) gibi çok sayıda lipid türlerinin belirlenmesi için yeni bir nicel lipidomics yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, şu anda, lipidler, hassasiyet ve hız çeşitli moleküler formları çözmek için yeteneği lipid tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılabilir yöntemleri aşıyor.
Abstract
Lipidler biyomoleküllerin ana sınıfları ve önemli roller zarı dinamikleri, enerji depolama oynamak ve sinyalizasyon
Protocol
Gereç ve yöntem
- Maya suşları ve büyüme koşulları
Yabani tip suşu BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) (% 1 maya özü,% 2 pepton,% 2 glukoz), zengin bir YEPD ortamda yetişmiştir . Hücreler, 30 ° C dönüş 05:01 "balon hacim / orta hacimli" oranı Erlenmeyer matara 200 rpm'de sallayarak kültüre edildi. - Lipid çıkarılması için maya hücreleri Depolama
- 50 ml hücre kültür 3000 xg'de 5 dakika santrifüj yoluyla toplandı.
- Iki kez soğuk su ile yıkanır.
- 25 ml buz gibi su içinde süspanse edin pelet
- 3000 xg'de 5 dakika santrifüj Pelet hücreleri
- Eppendorf tüp pelet ve transfer süspanse edin
- Pelet, santrifüj yoluyla, kullanılıncaya kadar -80 ° C'de 2 dakika boyunca 16.000 xg, supernatant ve donma kaldırmak. (Beher izopropil alkol kullanan, sıvı nitrojen de kullanılabilir -80 dondurucuda muhafaza)
- Reaktifler
Biyoteknoloji sınıf kloroform ve metanol, Sigma-Aldrich. Serbest yağ asitleri ve triaçilgliseroller Larodan (Malmö, İsveç) satın alındı. Fosfolipidlerin çeşitli türler - fosfatidilkolin, phosphatidylethanolamine fosfatidilinositol, fosfatidilserin, phosphatidic asit ve cardiolipins de dahil olmak üzere - Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, ABD) elde edilmiştir. Fisher, Teflon kaplı kapaklar ile Yüksek hızda cam santrifüj tüplerine.
Lipid çıkarma
Bu Bligh ve Dyer 8 tarafından açıklanan protokol bir değişiklik. Çıkarılan lipidler ile tüm manipülasyonlar cam pipetler veya şırınga kullanılarak yapılmalıdır; kloroform ile temas eden plastik geniş bir arka plan sinyali yaratacak. MeOH - H 2 kloroform 3. adımda O ve 2:2:1.8 - MeOH-H 2 O adım 7 korunmuş kloroform 1:2:0.8 oranları gibi kesin miktarlar sürece kritik değildir.
- Buz gibi distile H 2 O. 1.6 ml donmuş hücreleri yeniden süspanse
- Yüksek hızda cam santrifüj tüplerine 1.6 ml hücre süspansiyonu aktarın.
- Kloroform ve MeOH (1:2) karışımı ve cam boncuklar hücre süspansiyonu 0.8 ml 6 ml ekleyin.
- Vortex cam boncuk, 1 dakika boyunca iki kez hücre süspansiyonu.
- 2 ml kloroform ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- Ara sıra karıştırma ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Distile H 2 O 2 ml ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- Ara sıra karıştırma ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3000 xg'de santrifüjleyin.
- Tüm sıvı faz yeni bir yüksek hızlı cam santrifüj tüpü içine toplayın.
- 3.2 ml kloroform adım 9 hücre pelet ekleyin.
- 1 dakika boyunca iki kez Vortex.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3000 xg'de santrifüjleyin.
- Adım 10 ile sıvı faz süpernatant ekleyin.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3000 xg'de santrifüjleyin.
- Üst faz (sulu) yeni bir yüksek hızlı cam santrifüj tüpü içine atın ve alt (organik) faz transfer.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3000 xg'de santrifüjleyin.
- Bir cam şişenin içine tüm süpernatantı transferi ve azot gazı altında kuru.
- -20 ° C'de 500 kloroform ul ve mağaza lipid filmi çözülür
Kütle spektrometresi Lipidlerin Analizi
-% 0.1 ile kloroform (1:1) (v / v) amonyum hidroksit, kloroform lipid standartlarının stok karışımı olarak Tablo 1, yanı sıra MeOH bir stok solüsyonu başına önceden hazırlanmış olmalıdır.
- Enjeksiyon için, önce, Tablo 1'de verilen lipitlerin standart karışımı 10 ul ile 10 ul bir örnek birleştirir. 01:01 kloroform, 200μL:% 0.1 NH 4 OH metanol.
- Örnek oranı standart gerektiği gibi değiştirilebilir.
- 1 ul / dk akış hızında bir nano-elektrosprey kaynak kodlu işletim ile donatılmış bir Micromass 2 Q-TOF kütle spektrometresi kullanarak lipidler giderin.
- Tam enstrüman parametreleri alet enstrüman değişecektir. Nano-elektrosprey kaynağı ile donatılmış bir Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, USA) için ayarları için Tablo 2'ye bakınız. Biz, bir Q-TOF kütle spektrometresi tip yüksek çözünürlüklü avantajı olmasına rağmen, bu zorunlu değildir.
- Kazanılmasından sonra kütle spektrumları düzeltti, arka plan çıkarılır ve ortalanmış ve sonra pik listesini Excel'e. Her lipid sınıfı doruklarına sonra kendi iç standart normalize edilirler. Uygulamaya bağlı olarak, deisotoping ve deconvolution olarak daha fazla post-processing gerçekleştirmek yapmak gerekli olabilir.
Tablo 1. İç lipid standartları, konsantrasyonlardastandart karışımı ve bunların analizi için MS modu.
| Lipid sınıf | Standart zinciri kompozisyon | Standart kütlesi | Konsantrasyon (mg / ml) | MS modu |
| Phosphatidic asit | 14:00 / 14:00 | 591,40 | 100 | Negatif |
| Phosphatidylethanolamine | 14:00 / 14:00 | 634,45 | 200 | Negatif |
| Fosfatidilinositol | N / A | N / A | N / A | Negatif |
| Fosfatidilserin | 14:00 / 14:00 | 622,37 | 40 | Negatif |
| Kardiyolipin | 4x14: 0 | 619,92 | 100 | Negatif |
| Serbest yağ asitleri | 19:00 | 297,28 | 100 | Negatif |
| Fosfatidilkolin | 14:00 / 14:00 | 650,48 | 100 | Olumlu |
| Triaçilgliseroller | 13:0 / 13:0 / 13:0 | 698,63 | 200 | Olumlu |
(Tablo 2). Aracı bir Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, ABD) ayarları, bir nano-elektrosprey kaynağı ile donatılmıştır.
| Akış hızı | Koni gerilimi | Kılcal gerilimi | Çarpışma gaz | |
| Pozitif mod | 1μl/min | -28 - | 3.0 kv | 10 |
| Negatif modda | 1μl/min | 30 V | -3,2 Kv | 10 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, maya lipidome hazır, ucuz malzemeler kullanılarak hızlı bir nicel değerlendirme sağlar. Bu lipitlerin lityum hidroksit ile amonyum hidroksit yerini tespit edilebilir olsa da, yöntemi, diacylglycerols, ergosterols ve ergosteryl esterleri hariç maya hücreleri bulunan lipid türlerinin çoğunun kimlik sağlar. Açıklanan yöntem konsantrasyonu doğrusallık büyüklüğü 2 ila 3 siparişleri (lipid türler bağlı olarak) yayılarak, mcg / ml olarak düşük konsantrasyonlarda lipid tanımlanması ve ölçülmesi sağlar. Fosfatidilinositol için uygun standartlar piyasada mevcut olmamasına rağmen, bu fosfolipid farklı moleküler formları diğer fosfolipid türleri için standartlar kullanılarak değerlendirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Alain Tessier değerli tavsiyelerde, tartışmalar ve teknik destek için minnettarız. Biz üstün hizmetler için Concordia Üniversitesi Biyolojik Kütle Spektrometresi Uygulamaları Merkezi kabul etmiş sayılırsınız. Bu çalışma CIHR ve Kanada NSERC hibe ile desteklendi. VIT CIHR Yeni Araştırmacı ve Genomik Concordia Üniversitesi Araştırma Başkanı, Hücre Biyolojisi ve Yaşlanma.
References
- Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
- Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
- Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
- Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
- Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
- Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
- Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
