蛋白酶荧光检测试剂盒，用它来确定蛋白酶活性

Summary

蛋白酶荧光检测试剂盒是专为使用蛋白酶活性荧光测量。它也是适合的蛋白酶污染的痕量检测。该方法是基于对专利配方的一个FITC标记的酪蛋白底物的水解hydroysis。

Abstract

蛋白酶荧光检测试剂盒提供了现成使用的试剂，检测蛋白酶活性的存在。这个简单的实验，检测蛋白酶活性使用酪蛋白为底物异硫氰酸荧光素（FITC）标记。

成更小的碎片，没有在酸性条件下沉淀的FITC标记的酪蛋白底物裂解蛋白酶活性的结果。蛋白酶样品和基板的潜伏期后，与另外三氯乙酸（TCA）的酸化反应。然后将混合物离心未消化形成一种颗粒较小，酸溶液中剩余的可溶性片段的衬底。上清瓦解和FITC标记的片段荧光测量。

所描述的套件程序检测胰蛋白酶蛋白酶浓度约为0.5微克/毫升（5胰蛋白酶吴检测）的控制。这种敏感性可以增加一个潜伏期较长时间，最长为24小时。在离心管进行检测和荧光检测使用的是试管或多孔板提供程序。

Protocol

编制说明

孵化缓冲区，缓冲区分析，并为0.6 N三氯乙酸溶液提供现成的解决方案。

FITC -酪蛋白衬底 - 这是建议分装成较小容量的到来，以避免反复冻融循环后，FITC -酪蛋白基板。如果FITC -酪蛋白衬底受到反复冻融略有增加，在后台会发生，从而降低灵敏度。等份应储存在-20 ° C，避光。每个样品，空白或控制的反应需要20μLFITC -酪蛋白衬底。冻结/解冻，以及大力搅拌或摇晃，可能会导致的FITC标记的分离在一个较高的背景阅读并导致更少的基板可用于蛋白酶切割产生的酪蛋白。

异硫氰酸荧光素（FITC）控制解决方案的FITC标记的控制，可检测缓冲液中重组，以适当的浓度。这个解决方案应该是新鲜和避光。

最后的胰蛋白酶控制解决方案 - 1毫米的盐酸中加入100μL胰蛋白酶，蛋白酶控制（产品编号：T 6567）的小瓶。混合简要保证胰蛋白酶溶解。新增900孵化缓冲液拌匀。另外，其他的缓冲区可以使用，如果需要检测。最后工作的胰蛋白酶的浓度为20微克/μL。当准备编写胰蛋白酶控制解决方案，结合了正确的孵育缓冲液（1 9部分缓冲区的部分酸化胰蛋白酶）的酸性胰蛋白酶溶液的等分。在酸性条件下储存的胰蛋白酶，增加胰蛋白酶的稳定性。胰蛋白酶控制的解决方案是对温度敏感的，而不是在低浓度的稳定。
请审查工具包中的这些准备的解决方案的存储和稳定的技术公告。

程序

1. 这是最简单的控制，空白和样品都在同一时间准备。对于每一个测试样本中，孵育缓冲液20μL，20μLFITC -酪蛋白基板，和10μL的测试样品添加微量离心管。蛋白酶活性高的测试样品，样品稀释液可能是必需的。
2. 加入20μl孵育缓冲液，20μLFITC -酪蛋白基板，控制样品和10μL的离心管，准备适当的控制样本（见控制样本）。
3. 离心管加入20μL，孵育缓冲液，20μLFITC -酪蛋白基板，和10μL超纯水制备空白样品。
4. 轻轻地混合在37 ° C黑暗环境中为60分钟，每管和孵化。小心太大力不要混用，因为过多的动荡可能会导致高的荧光背景，并减少了检测的灵敏度。
   注：孵育时间可能会延长至24小时，以提高灵敏度。要小心，不要超过24小时，FITC -酪蛋白可能开始降低，导致高荧光背景。
5. 孵育后，添加150μL的0.6 N氯乙酸的解决方案，以每个离心管。 TCA是具有很强的腐蚀性，应穿着适当的防护设备，而处理。
6. 轻轻混匀，于37孵育° C 30分钟的黑暗环境​​中。
7. 10分钟，离心10,000 × G.管上清含有溶于酸，FITC标记的片段，并使用荧光测量。

荧光测量

这些方法可以缩小或根据现有的仪器的要求。比较适当的控制样本编制的标准曲线，减去空白样品，从每个测试样本值（FLUtest）（FLUblank）的荧光读数。

比色皿

1. 吸取10μL上清（步骤7）和1毫升到一个合适的比色皿测定缓冲区，并轻轻混匀。注：上清，检测缓冲的解决方案可能会储存在2-8℃，在黑暗中长达24小时前测量的荧光。
2. 记录485 nm处的荧光强度与激发和发射波长为535 nm监测。

多孔板

1. 吸取10μL上清（步骤7）和1毫升的检测到一个合适的试管或小瓶缓冲区，轻轻混匀注：上清，检测缓冲的解决方案，在2-8 ° C，最多可存储在黑暗中24小时前测量的荧光。
2. 将200μL以及黑色96孔板。记录485 nm处的荧光强度与激发和发射波长为535 nm监测。
   或者

1. 吸取2μL上清液（步骤7）和B的含量的200μLuffer成黑色96孔板以及。注：上清，检测缓冲的解决方案可能会储存在2-8℃，在黑暗中长达24小时前测量的荧光。
2. 记录485 nm处的荧光强度与激发和发射波长为535 nm监测。

控制样本

胰蛋白酶控制解决方案可用于确认检测是正确执行，以确定检测限，或创建一个通用的标准曲线。对于不同的检测，特异性蛋白酶，它是建议准备控制在适当的孵化缓冲液中含有特异性蛋白酶。

检测的检测限是蛋白酶，产生显着高于空白样品中获得的价值的荧光读。取决于仪器的灵敏度，检测限会有所不同。胰蛋白酶控制解决方案的系列稀释，可用于生成控制解决方案。

阅读等于120％，与空白样品中获得的价值被认为是重要的。常规检测胰蛋白酶的5纳克的限制与此过程中获得。建议每次检测至少有一个5吴胰蛋白酶控制运行。胰蛋白酶的浓度为0.5微克/毫升与控制解决方案所需的5胰蛋白酶吴检测结果。一个40倍稀释液，胰蛋白酶控制解决方案（20微克/毫升）的结果在0.5微克/毫升的控制解决方案，即胰蛋白酶39部分孵化缓冲控制解决方案的一部分。

图1（胰蛋白酶的活性标准曲线）：胰蛋白酶控制解决方案（20微克/毫升），也可用于生成通过连续稀释的标准曲线（见图1） 。每个控制样品的荧光读数减去空白样品荧光读值从每个控制样品（FLUcontrol）（FLUblank）已得到纠正。

典型的胰蛋白酶“（产品代码T 6567）的标准曲线，使用该试剂盒和控制范围从0.15微克/毫升（1.5纳克）至2.5微克/毫升（25毫微克）的样品。这条曲线是由以下所描述的过程，孵化时间30分钟步骤4产生。在多孔板，荧光测量。

异硫氰酸荧光素作为一种可能的校准仪器的控制（见相应的制造商的指示）或FITC标记信号的线性范围的确定。

Discussion

我们刚刚例如检测使用蛋白酶荧光检测试剂盒来检测生物样品中蛋白酶的活性。该试剂盒进行了优化，检测发现在生理应用的蛋白酶的多元化。它是适用于检测丝氨酸，半胱氨酸的金属，和天门冬氨酸蛋白酶;然而，可能需要修改，​​以检测某些特定的蛋白酶。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Fluorescent Detection Kit	Sigma-Aldrich	PF0100
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758