Biology

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

Published: August 4, 2009 doi: 10.3791/1514

Summary

Die Protease Fluorescent Detection Kit ist für die Messung der Protease-Aktivität mit Fluorometrie konzipiert. Es eignet sich auch zum Nachweis von Spuren von Protease-Kontamination. Die Methode basiert auf der proteolytischen hydroysis von einer proprietären Rezeptur eines FITC-markiertem Casein Substrat.

Abstract

Die Protease Fluorescent Detection Kit bietet ready-to-use Reagenzien für den Nachweis von Protease-Aktivität. Dieser einfache Test auf Protease-Aktivität zu erkennen nutzt Kasein mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) als Substrat bezeichnet.

Protease-Aktivität führt zur Spaltung der FITC-markiertem Casein Substrat in kleinere Fragmente, die nicht ausfallen müssen unter sauren Bedingungen. Nach der Inkubation der Protease Probe und Substrat wird die Reaktion mit der Zugabe von Trichloressigsäure (TCA) angesäuert. Die Mischung wird dann mit dem unverdauten Substrat und bildet eine Pellet-und die kleineren, säurelöslichen Fragmenten in Lösung bleibt zentrifugiert. Der Überstand wird neutralisiert und die Fluoreszenz des FITC-markierten Fragmente gemessen wird.

Die beschriebenen Kit Verfahren erkennt die Trypsin-Protease-Steuerung in einer Konzentration von etwa 0,5 pg / ml (5 ng Trypsin hinzugefügt, um die Assay). Diese Empfindlichkeit kann mit einer längeren Inkubationszeit erhöht werden, bis zu 24 Stunden. Der Test wird in Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt und die Verfahren für die Fluoreszenzdetektion entweder mit Küvetten oder Mikrotiterplatten zur Verfügung gestellt.

Protocol

Herstellvorschrift

Inkubationspuffer, Assay-Puffer und 0,6 N TCA-Lösung als ready-to-use-Lösungen zur Verfügung gestellt.

Die FITC-Casein Substrat - Es ist zu Aliquot der FITC-Casein Substrat in kleineren Mengen bei der Ankunft auf wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden empfohlen. Wenn die FITC-Casein Substrat wiederholt Gefrier-Auftau-Zyklen unterworfen ist, wird ein leichter Anstieg in den Hintergrund treten, dadurch Senkung der Empfindlichkeit. Die Aliquots bei -20 ° C gelagert werden und vor Licht geschützt. Jede Probe, erfordert leer oder Kontrollreaktion 20 ul der FITC-Casein Substrat. Frost / Tau-sowie kräftiges Mischen oder Schütteln kann der FITC aus dem Casein was zu einer höheren Hintergrund Lesen und verursacht weniger Substrat zur Verfügung zu stehen Proteaseschnittstelle trennen.

Die Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Control Solution-Der FITC-Steuerung kann in Assay-Puffer auf die geeignete Konzentration aufgelöst werden. Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden und vor Licht geschützt.

Finale der Trypsin-Control-Lösung - 100 l von 1 mM HCl in das Fläschchen von Trypsin, Protease Control (Product Code T 6567). Mix kurz, um sicherzustellen, das Trypsin gelöst ist. Add 900 ul Inkubationspuffer und gut mischen. Alternativ können auch andere Puffer verwendet werden, wenn für den Test gewünscht wird. Die letzte Arbeit Konzentration der Trypsin ist 20 ug / ul. Wenn Sie bereit sind, die Trypsin-Control-Lösung vorbereiten, kombinieren einen aliquoten Teil der sauren Trypsin-Lösung mit der richtigen Menge der Inkubationspuffer (1 Teil angesäuert Trypsin zu 9 Teilen Puffer). Das Speichern der Trypsin unter sauren Bedingungen erhöht die Stabilität des Trypsin. Die Trypsin-Lösung ist temperaturempfindlich ist und nicht in niedrigen Konzentrationen stabil.
Bitte überprüfen Sie die Kits technischen Merkblatt für die Lagerung und die Stabilität dieser Lösungen vorbereitet.

Verfahren

Am einfachsten ist es, die Kontrollen, Blindproben und Proben aller Vorbereitung auf einmal. Für jede Probe werden 20 ul Inkubationspuffer, 20 ul von FITC-Casein Substrat, und 10 ul der Probe zu einem Reaktionsgefäß. Für Proben mit hohen Protease-Aktivität kann Probenverdünnung erforderlich sein.
Bereiten Sie entsprechende Kontrollproben (siehe Kontrollproben) durch Zugabe von 20 ul Inkubationspuffer, 20 ul von FITC-Casein Substrat, und 10 ul der Kontrollprobe ein Mikrozentrifugenröhrchen.
Bereiten Sie eine leere Probe durch Zugabe von 20 ul Inkubationspuffer, 20 ul von FITC-Casein Substrat, und 10 ul Reinstwasser auf ein Mikrozentrifugenröhrchen.
Vorsichtig mischen jedes Rohr und bei 37 ° C im Dunkeln für 60 Minuten. Seien Sie vorsichtig, nicht zu kräftig mischen, da übermäßige Turbulenzen hohen Fluoreszenz-Hintergrund führen können und reduzieren Sie die Empfindlichkeit des Tests.
Hinweis: Die Inkubationszeit kann bis zu 24 Stunden verlängert werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Achten Sie darauf, 24 Stunden überschreiten, wie die FITC-Casein kann beginnen sich zu zersetzen, was zu hohen Fluoreszenz-Hintergrund.
Nach der Inkubation add 150 ul der 0,6 N Trichloressigsäurelösung jedes Mikrozentrifugenröhrchen. TCA ist stark ätzend und sollten so behandelt, während das Tragen der entsprechenden Schutzausrüstung.
Vorsichtig mischen und bei 37 ° C im Dunkeln für 30 Minuten.
Zentrifugieren für 10 Minuten bei 10.000 x g. Der Überstand enthält die Säure löslich, FITC markierten Fragmente und ist für die Fluoreszenz-Messung verwendet.

Fluoreszenz-Messungen

Diese Methoden können skaliert werden oder nach unten entsprechend den Anforderungen der Instrumentierung zur Verfügung. Zum Vergleich mit einer Standardkurve mit den entsprechenden Kontrollproben vorbereitet, subtrahieren die Fluoreszenz Lesung der Blindprobe (FLUblank) aus dem Wert von jeder Testprobe (FLUtest).

Küvetten

Je 10 ul des Überstandes (Schritt 7) und 1 ml der Assay-Puffer in eine geeignete Küvette und vorsichtig mischen. Hinweis: Die Lösung des Überstands und Assay-Puffer können im Dunkeln bei 2-8 ° C gelagert werden bis zu 24 Stunden vor der Messung der Fluoreszenz.
Notieren Sie sich die Fluoreszenz-Intensität mit einer Anregung bei 485 nm und Überwachung der Emissions-Wellenlänge von 535 nm.

Multiwell Platten

Je 10 ul des Überstandes (Schritt 7) und 1 ml der Assay-Puffer in ein geeignetes Röhrchen oder Fläschchen geben und vorsichtig mischen Hinweis: Die Lösung des Überstands und Assay-Puffer können im Dunkeln bei 2-8 ° C für bis abgelegt bis 24 Stunden vor der Messung der Fluoreszenz.
Transfer-200 ul in eine Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte. Notieren Sie sich die Fluoreszenz-Intensität mit einer Anregung bei 485 nm und Überwachung der Emissions-Wellenlänge von 535 nm.
Oder

Pipette 2 ul des Überstandes (Schritt 7) und 200 ul der Assay BUffer in eine Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte. Hinweis: Die Lösung des Überstands und Assay-Puffer können im Dunkeln bei 2-8 ° C gelagert werden bis zu 24 Stunden vor der Messung der Fluoreszenz.
Notieren Sie sich die Fluoreszenz-Intensität mit einer Anregung bei 485 nm und Überwachung der Emissions-Wellenlänge von 535 nm.

Kontrollproben

Die Trypsin-Control-Lösung kann verwendet werden um zu bestätigen, ist der Test korrekt durchführen, um die Nachweisgrenze zu bestimmen, oder erstellen Sie einen allgemeinen Standard-Kurve liegen. Für den Test eines anderen, spezifische Protease, ist es empfehlenswert, eine Kontroll-Lösung, welche die spezifische Protease in den entsprechenden Inkubationspuffer vorzubereiten.

Die Nachweisgrenze des Tests ist die Menge der Protease, die eine deutliche Fluoreszenz Lesung über den Wert mit der Blindprobe erhalten produziert. Die Nachweisgrenze ist abhängig von der Empfindlichkeit der Instrumente. Serielle Verdünnungen der Trypsin-Control-Lösung kann verwendet werden, um die Control-Lösungen zu generieren.

Eine Lesung in Höhe von 120% des Wertes der Blindprobe erhält man als signifikant betrachtet. Routinemäßig wurde eine Nachweisgrenze von 5 ng Trypsin mit diesem Verfahren erhalten. Es wird empfohlen, mindestens eine 5 ng Trypsin-Steuerung mit jedem Test ausgeführt werden. Ein Trypsin-Lösung mit einer Konzentration von 0,5 ug / ml würden in der gewünschten 5 ng Trypsin im Test führen. Ein 40-fachen Verdünnung des Trypsin-Control-Lösung (20 ug / ml) ergibt sich ein 0,5 ug / ml Kontroll-Lösung, dh ein Teil der Trypsin-Control-Lösung zu 39 Teilen Inkubationspuffer.

Abbildung 1 (Standard Curve von Trypsin Activity): Die Trypsin-Control-Lösung (20 pg / ml) kann auch verwendet werden, um eine Standardkurve, indem serielle Verdünnungen zu erzeugen (siehe Abbildung 1). Die Fluoreszenz Lesen von jeder Kontrolle Probe wurde durch Subtraktion der Fluoreszenz-Lesung der Blindprobe (FLUblank) aus dem Wert der einzelnen Kontrollprobe (FLUcontrol) korrigiert.

Typische Standardkurve für Trypsin (Product Code T 6567) mit diesem Kit und Kontrollproben von 0,15 pg / ml (1,5 ng) auf 2,5 pg / ml (25 ng). Diese Kurve wurde gemäß dem beschriebenen Verfahren, mit einer Inkubationszeit von 30 Minuten für Schritt 4 erzeugt. Fluoreszenz-Messungen wurden in einer Multi-Well-Platte.

Fluoresceinisothiocyanat ist als Kontrolle für mögliche Gerätekalibrierung (siehe entsprechende Anweisungen des Herstellers) oder die Bestimmung der Linearitätsbereich der FITC-Signal zur Verfügung gestellt.

Discussion

Wir haben gerade ein Beispiel Assay gezeigt mit der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität in einer biologischen Probe zu erkennen. Dieses Kit wurde optimiert, um ein breites Spektrum von Proteasen in physiologischen Anwendungen gefunden zu erkennen. Es eignet sich zum Nachweis von Serin, Cystein-, Metallo-und Aspartylproteasen, aber Modifikationen erforderlich, um einige spezifische Proteasen zu erkennen.