שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

Summary

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מיועד למדידת פעילות הפרוטאז באמצעות fluorometry. זה מתאים גם זיהוי של כמויות זעירות של זיהום פרוטאז. השיטה מבוססת על hydroysis פרוטאוליטי של ניסוח קניינית של מצע קזאין FITC שכותרתו.

Abstract

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מספק מוכן לשימוש ריאגנטים לגילוי נוכחות של פעילות הפרוטאז. Assay זה פשוט לזהות פעילות הפרוטאז משתמש שכותרתו קזאין כמו המצע עם isothiocyanate והעמסת (FITC).

פעילות פרוטאז תוצאות המחשוף של המצע קזאין FITC שכותרתו לרסיסים קטנים, אשר אינם לזרז בתנאים חומציים. לאחר דגירה של המדגם פרוטאז ואת המצע, התגובה היא acidified עם תוספת של חומצה Trichloroacetic (TCA). התערובת היא centrifuged אז עם המצע מעוכלים להרכיב גלולה ואת קטנים, שברי מסיס חומצה שנותרו פתרון. Supernatant היא לנטרל את הקרינה של ה-FITC שכותרתו שברי נמדד.

ההליך המתואר הערכה מזהה את השליטה הפרוטאז טריפסין בריכוז של כ 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​(5 ng של טריפסין הוסיף assay). רגישות זו יכולה להיות מוגברת עם זמן דגירה ארוכה יותר, עד 24 שעות. Assay מתבצעת צינורות microcentrifuge והנהלים ניתנים לאיתור באמצעות פלואורסצנציה או cuvettes או צלחות multiwell.

Protocol

הוראות הכנה

מאגר הדגירה, Buffer Assay, ו 0.6 פתרון N TCA מסופקים מוכן לשימוש פתרונות.

המצע FITC-קזאין - מומלץ aliquot המצע FITC-קזאין לתוך נפח קטן יותר עם הגעתו, כדי למנוע חזרה להקפיא להפשיר מחזורים. אם המצע FITC-קזאין נתונה להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים, עלייה קלה ברקע יתרחש, ובכך להקטין את הרגישות. Aliquots צריך להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור. מדגם כל, התגובה ריק, או לשלוט דורש 20 μl של המצע FITC-קזאין. הקפאה / הפשרה, כמו גם ערבוב נמרץ או רועד יכול לגרום FITC כדי להפריד בין קזאין שהתקבל ברקע גבוה קריאה גרימת המצע פחות להיות זמין עבור מחשוף פרוטאז.

Isothiocyanate והעמסת (FITC), פתרון בקרת השליטה FITC ניתן מחדש של הצפת Assay לריכוז המתאים. פתרון זה צריך להיעשות טריים מוגן מפני אור.

הפתרון הסופי הבקרה טריפסין - הוסף 100 μl של 1 mM HCl כדי בקבוקון של טריפסין, פרוטאז Control (קוד מוצר T 6567). מערבבים בקצרה, כדי להבטיח את טריפסין הוא מומס. הוסף 900 ​​μl של הצפת הדגירה ומערבבים היטב. לחלופין, מאגרים אחרים עשויים לשמש אם רוצים עבור assay. ריכוז העבודה הסופית של טריפסין הוא 20 מיקרוגרם / μl. כאשר מוכן להכין את פתרון בקרת טריפסין, לשלב aliquot הפתרון טריפסין חומצי עם כמות נכונה של הצפת הדגירה (1 acidified חלק טריפסין למאגר חלקי 9). אחסון טריפסין בתנאים חומצי מגביר את היציבות של טריפסין. הפתרון לשלוט טריפסין רגיש טמפרטורה אינו יציב בריכוזים נמוכים.
נא לעיין בעלון הטכני של ערכת לאחסון והיציבות של הפתרונות הללו מוכנים.

נוהל

1. זה הכי קל להכין שולטת, החסר, ואת כל הדגימות בבת אחת. עבור כל מדגם הבדיקה, להוסיף 20 μl של הצפת דגירה, 20 μl של המצע FITC-קזאין, ו 10 μl של מדגם הבדיקה לצינור microcentrifuge. לקבלת דוגמיות מבחן עם פעילות הפרוטאז גבוהה, דילול מדגם ייתכן שתידרש.
2. הכינו דגימות בקרה מתאימה (ראה דוגמאות הבקרה) על ידי הוספת 20 μl של הצפת דגירה, 20 μl של המצע FITC-קזאין, ו 10 μl של המדגם שליטה צינור microcentrifuge.
3. הכן מדגם ריק ידי הוספת 20 μl של הצפת דגירה, 20 μl של המצע FITC-קזאין, ו 10 μl מים ultrapure לצינור microcentrifuge.
4. לערבב בעדינות כל צינור לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 60 דקות. היזהר לא לערבב יותר מדי במרץ, כמו מערבולת מופרז עלול לגרום רקע הקרינה גבוהה להפחית את הרגישות של assay.
   הערה: זמן דגירה ניתן להאריך עד 24 שעות כדי להגביר את הרגישות. היזהר שלא יעלה על 24 שעות כמו FITC-קזאין עשויים להתחיל לבזות, המוביל רקע הקרינה גבוהה.
5. לאחר דגירה להוסיף 150 μl הפתרון N 0.6 חומצה Trichloroacetic אל צינור כל microcentrifuge. TCA היא מאכל מאוד יש לטפל תוך לבישת ציוד מגן מתאים.
6. לערבב בעדינות לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 30 דקות.
7. צנטריפוגה צינורות במשך 10 דקות על 10,000 x ז Supernatant מכיל חומצה מסיסים, שברי שכותרתו FITC והוא משמש למדידת הקרינה.

מדידות הקרינה

שיטות אלה תשודרג כלפי מעלה או מטה בהתאם לדרישות של המכשור זמין. לשם השוואה עקומת סטנדרט מוכן עם דגימות בקרה מתאימה, לחסר הקריאה הקרינה של המדגם ריק (FLUblank) מהערך של מדגם הבדיקה (FLUtest).

Cuvettes

1. פיפטה 10 μl של supernatant (שלב 7) ו - 1 מ"ל של הצפת Assay לתוך קובט מתאים ומערבבים בעדינות. הערה: פתרון של הצפת supernatant ו Assay ניתן לאחסן בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה.
2. רשום את עוצמת הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר וניטור אורך הגל פליטה של ​​535 ננומטר.

Multiwell פלטות

1. פיפטה 10 μl של הערה supernatant (שלב 7) 1 מ"ל של הצפת Assay לתוך צינור הבקבוקון מתאים או ומערבבים בעדינות: הפתרון של הצפת supernatant ו Assay ניתן לאחסן בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס עד עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה.
2. העברת 200 μl לבאר צלחת 96 שחור טוב. רשום את עוצמת הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר וניטור אורך הגל פליטה של ​​535 ננומטר.
   או

1. פיפטה 2 μl של supernatant (שלב 7) ו - 200 μl של B Assayuffer לבאר צלחת 96 שחור טוב. הערה: פתרון של הצפת supernatant ו Assay ניתן לאחסן בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה.
2. רשום את עוצמת הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר וניטור אורך הגל פליטה של ​​535 ננומטר.

בקרת דוגמאות

פתרון בקרת טריפסין ניתן להשתמש כדי לאשר assay הוא מבצע כראוי, כדי לקבוע את גבול הגילוי, או ליצור עקומת סטנדרט כללי. עבור assay של פרוטאז אחר, ספציפי, מומלץ להכין פתרון בקרת המכיל את פרוטאז ספציפי למאגר הדגירה המתאים.

גבול הגילוי של assay הוא כמות פרוטאז שמייצר קריאה הקרינה משמעותית מעל הערך שהושג עם המדגם ריק. גבול הגילוי ישתנה בהתאם הרגישות של המכשור. דילולים סידורי הפתרון בקרת טריפסין עשויים לשמש ליצירת פתרונות שליטה.

שווה קריאה עד 120% מהשווי המתקבל עם המדגם ריק נחשב משמעותי. באופן שגרתי, הגבלה של גילוי של ng 5 של טריפסין התקבל עם הליך זה. מומלץ כי לפחות אחד 5 שליטת ng טריפסין להתנהל עם כל assay. פתרון בקרת טריפסין עם ריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​תגרום ng 5 הרצויה של טריפסין ב assay. דילול של פי 40 הפתרון בקרת טריפסין (20 מיקרוגרם / מ"ל) תוצאות בפתרון מיקרוגרם / מ"ל ​​0.5 שליטה, כלומר חלק אחד של פתרון בקרת טריפסין עד 39 חלקים של הצפת דגירה.

איור 1 (Curve האחיד של פעילות טריפסין): הפתרון בקרת טריפסין (20 מיקרוגרם / מ"ל) עשוי לשמש גם כדי ליצור עקומת סטנדרט ידי ביצוע דילולים סדרתי (ראה איור 1). הקריאה הקרינה של המדגם כל פקד תוקנה על ידי הפחתת הקרינה קריאה של המדגם ריק (FLUblank) מהערך של המדגם כל פקד (FLUcontrol).

עקומת סטנדרט אופיינית עבור טריפסין (קוד מוצר T 6567) באמצעות ערכת דגימות השליטה החל 0.15 מיקרוגרם / מ"ל ​​(ננוגרם 1.5) על 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​(ננוגרם 25). עקומת הזה נוצר על ידי ביצוע ההליך המתואר, עם זמן דגירה של 30 דקות עבור לשלב 4. מדידות הקרינה שנעשו צלחת multiwell.

Isothiocyanate והעמסת מסופק כביקורת לצורך כיול מכשיר אפשרי (ראו הוראות היצרן המתאים) או קביעת טווח הלינאריות של האות FITC.

Discussion

הראינו רק assay למשל באמצעות ערכת פלורסנט פרוטאז איתור לזהות פעילות הפרוטאז במדגם ביולוגי. ערכה זו כבר אופטימיזציה לאתר מגוון רחב של פרוטאזות למצוא יישומים פיזיולוגיים. הוא מתאים לכל גילוי של ציסטאין סרין, Metallo ו פרוטאזות אספרטית, אולם שינויים עשויים להידרש לזהות כמה פרוטאזות ספציפיות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Fluorescent Detection Kit	Sigma-Aldrich	PF0100
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758