Biology

プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

Published: August 4, 2009 doi: 10.3791/1514

Summary

プロテアーゼ蛍光検出キットは、蛍光を用いたプロテアーゼ活性の測定のために設計されています。また、プロテアーゼのコンタミの微量の検出に適しています。メソッドは、FITC標識カゼイン基質の独自の製剤のタンパク質分解hydroysisに基づいています。

Abstract

プロテアーゼ蛍光検出キットは、既製使用するプロテアーゼ活性の存在を検出するための試薬を提供する。プロテアーゼ活性を検出するためにこの簡単なアッセイは、カゼインを基質としてフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識使用しています。

プロテアーゼ活性の酸性条件下で沈殿しないより小さい断片にFITC標識カゼイン基質の開裂の結果。プロテアーゼのサンプルと基質のインキュベーション後、反応をトリクロロ酢酸（TCA）の添加により酸性化する。次いで、混合物をペレットと溶液中に残存する小規模な、酸可溶性フラグメントを形成する未消化の基質を用いて遠心分離する。上清を中和され、FITCラベルされた断片の蛍光を測定する。

記載のキットの手順では、約0.5μg/ mlの（トリプシンの5 ngの検定に追加された）の濃度でトリプシンのプロテアーゼ制御を検出します。この感度は、24時間まで、長いインキュベーション時間を増やすことができます。アッセイは、マイクロ遠心チューブ中で実行され、手続きは、キュベットまたはマルチウェルプレートのどちらかを使用して、蛍光検出のために用意されています。

Protocol

準備の手順

インキュベーションバッファー、アッセイバッファー、および0.6 N TCAソリューションは、すぐに使えるソリューションとして提供されています。

FITC -カゼイン基質 - それはアリコートに凍結融解の繰り返しを避けるために到着時に小さなボリュームに分割しFITC -カゼイン基質をお勧めします。 FITC -カゼイン基質が凍結融解の繰り返し印加された場合、バックグラウンドでのわずかな増加は、感度を下げ、それによって、発生します。アリコートを-20℃で保存し、光から保護する必要があります。各サンプル、ブランク、またはコントロールの反応では、FITC -カゼイン基質20μlを必要とします。ミキシングや揺れ活発なだけでなく、融解/凍結とFITCは、プロテアーゼの切断のために利用できるように小さい基板を読み、原因と高いバックグラウンドで生じるカゼインから分離することがあります。

フルオレセインイソチオシアネート（FITC）コントロールソリューション- FITC制御は、適切な濃度にアッセイ緩衝液で再構成することができます。このソリューションは、新鮮なものと、光から保護する必要があります。

最終的なトリプシンコントロールソリューション - トリプシン、プロテアーゼ制御（商品コードT 6567）のバイアルに1mMのHClの100μlを追加する。トリプシンが溶解されるように簡単に混ぜる。インキュベーションバッファー900μLを加え、よく混ぜる。アッセイに必要に応じて別の方法として、他のバッファを使用することができます。トリプシンの最終的な作業濃度は20μg/μLのです。ときにトリプシンコントロールソリューションを準備する準備ができて、インキュベーションバッファー（9部のバッファに1部の酸性化トリプシン）の正確な量の酸性トリプシン溶液のアリコートを組み合わせる。酸性条件下でトリプシンを保存すると、トリプシンの安定性を高めます。トリプシン制御ソリューションは、温度に敏感であり、低濃度で安定していないです。
これらの準備のソリューションの貯蔵と安定性のためのキットの技術的なセキュリティ情報を確認してください。

手順

一度にすべてのコントロール、空白、およびサンプルを調製するのが最も簡単です。各試験サンプルについて、マイクロ遠心チューブにインキュベーションバッファー20μlを、FITC -カゼイン基質液20μl、試験試料の10μlを加える。高いプロテアーゼ活性を有する試験片の場合は、サンプルの希釈が必要な場合があります。
マイクロ遠心チューブにインキュベーションバッファー20μlを、FITC -カゼイン基質液20μl、およびコントロールサンプルの10μlを添加することにより、適切なコントロールのサンプル（コントロールサンプルを参照）を準備。
マイクロ遠心チューブにインキュベーションバッファー20μlを、FITC -カゼイン基質液20μl、及び超純水10μlを添加してブランクサンプルを準備します。
静かに37 60分間暗所で℃で各チューブとインキュベートを混ぜる。過度の乱流が高い蛍光バックグラウンドの原因とアッセイの感度を減少させる可能性があるので、あまりにも積極的に混合しないように注意してください。
注：インキュベーション時間は、感度を上げるために24時間まで延長することができる。高い蛍光バックグラウンドにつながる、FITC -カゼインが低下し始める可能性があるので24時間を超えないように注意してください。
インキュベーション後、各微量遠心チューブに0.6 Nトリクロロ酢酸溶液を150μlを加える。 TCAは、非常に腐食性があり、適切な保護具を着用して処理する必要があります。
ゆっくりと37℃で混合し、インキュベート℃で30分間、暗所で。
10,000 × gで10分間チューブを遠心上清は、酸可溶性、FITCラベルされた断片が含まれており、蛍光測定に使用されます。

蛍光測定

これらのメソッドは、利用可能な計装の要件に応じて上下に拡大または縮小することができます。適切なコントロールのサンプルで作製した標準曲線との比較のために、各試験サンプルの値（FLUtest）からブランクサンプル（FLUblank）の蛍光測定値を引きます。

キュベット

ピペット上清10μl（ステップ7）と適切なキュベットにアッセイ緩衝液1mlを、穏やかに混合する。注：最大24時間の蛍光を測定する前に、上清およびアッセイ緩衝液の溶液は2〜8℃で暗所に保存されていることがあります。
485nmで励起による蛍光強度を記録および535 nmの発光波長を監視する。

マルチウェルプレート

上清（ステップ7）と適切なチューブまたはバイアルにアッセイ緩衝液1mlを、穏やかに混合注ピペットを10μl：上清およびアッセイ緩衝液の溶液を、最大2〜8℃で暗所に保存することができる蛍光を測定する前に24時間まで。
黒色96ウェルプレートのウェルに200μlのを転送する。 485nmで励起による蛍光強度を記録および535 nmの発光波長を監視する。
や

ピペット上清2μlの（ステップ7）とアッセイB200μlの黒色96ウェルプレートのウェルにuffer。注：最大24時間の蛍光を測定する前に、上清およびアッセイ緩衝液の溶液は2〜8℃で暗所に保存されていることがあります。
485nmで励起による蛍光強度を記録および535 nmの発光波長を監視する。

コントロールのサンプル

トリプシンコントロールソリューションは、アッセイは、検出限界を決定する、または一般的な標準曲線を作成するには、適切に実行していることを確認するために使用することができます。異なる、特定のプロテアーゼのアッセイのために、それは適切なインキュベーションバッファー中で特異的プロテアーゼを含むコントロール溶液を調製することをお勧めします。

アッセイの検出限界は、ブランク試料で得られた値を上回る大幅な蛍光測定値を生成するプロテアーゼの量です。検出限界は、計測機器の感度によって異なります。トリプシンコントロールソリューションの連続希釈を制御ソリューションを生成するために使用されることがあります。

ブランクサンプルで得られた値の120％に等しい読書を有意とされる。日常的に、トリプシンの5 ngの検出限界は、この手順で得られた。それは、少なくとも一つの5 ngのトリプシンのコントロールがそれぞれのアッセイで実行することをお勧めします。の0.5μg/ mlの濃度でトリプシンの制御ソリューションは、アッセイにおけるトリプシンの所望の5 ngのことになります。トリプシンコントロールソリューションの40倍希釈（20μg/ ml）を0.5μg/ mLと制御ソリューション、インキュベーションバッファーの39部にトリプシンコントロールソリューションの、すなわち一部の結果。

図1（トリプシン活性の標準曲線）：トリプシンコントロールソリューション（20μg/ mlのは）また、（図1を参照）連続希釈を行うことによって標準曲線を生成するために使用されることがあります。各コントロールのサンプルの蛍光測定値は、各コントロールのサンプル（FLUcontrol）の値からブランク試料の蛍光読書（FLUblank）を差し引くことによって修正されました。

このキットは0.15μg/ mlの（1.5 ng）を、2.5μg/ mlの（25 ng）をするまで、コントロールサンプルを使用して、トリプシン（製品コードT 6567）の典型的な標準曲線。この曲線は、ステップ4の30分のインキュベーション時間を、記載された手順に従って生成されました。蛍光測定は、マルチウェルプレートで行われた。

フルオレセインイソチオシアネートは、可能な測定器の校正（該当する製造者の指示を参照）またはFITC信号の直線性の範囲の決定のためのコントロールとして提供されています。

Discussion

私達はちょうど生物学的試料中のプロテアーゼ活性を検出するためにプロテアーゼ蛍光検出キットを使用して例の分析を示している。このキットは、生理的なアプリケーションで見られるプロテアーゼの多様な範囲を検出するために最適化されています。それはセリン、システイン、メタロ、およびアスパラギン酸プロテアーゼの検出に適していますが、修正がいくつかの特定のプロテアーゼを検出するために必要となる場合があります。