Biology

Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

Published: August 4, 2009 doi: 10.3791/1514

Summary

O Kit de Detecção de Protease fluorescente é projetado para a medição da atividade da protease usando fluorometria. Também é adequado para a detecção de vestígios de contaminação protease. O método é baseado no hydroysis proteolítica de uma formulação de um substrato de caseína FITC-rotulados.

Abstract

O Kit de Detecção de Protease fluorescente fornece ready-to-use reagentes para a detecção da presença de atividade da protease. Este ensaio simples para detectar atividade de protease utiliza caseína marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) como substrato.

Protease atividade resulta na clivagem do substrato de caseína FITC-rotulados em fragmentos menores, que não precipitam em meio ácido. Após a incubação da amostra protease e substrato, a reação é acidificada com a adição de ácido tricloroacético (TCA). A mistura é então centrifugado com o substrato formando um pellet não digerido e as menores, fragmentos de ácido solúvel remanescente em solução. O sobrenadante é neutralizado ea fluorescência do FITC-rotulados fragmentos é medido.

O procedimento descrito kit detecta o controle protease tripsina em uma concentração de aproximadamente 0,5 mcg / ml (5 ng de tripsina adicionado ao ensaio). Esta sensibilidade pode ser aumentada com um maior tempo de incubação, até 24 horas. O ensaio é realizado em tubos de microcentrífuga e procedimentos são fornecidos para a detecção de fluorescência usando tinas ou placas de vários poços.

Protocol

Instruções de preparação

O tampão de incubação, Tampão de Ensaio, e 0,6 N Solução TCA são fornecidos como ready-to-use soluções.

O substrato FITC-caseína - Recomenda-se a alíquota do substrato FITC-caseína em volumes menores no momento da chegada para evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Se o substrato FITC-caseína é submetido a repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, um ligeiro aumento no fundo irá ocorrer, assim, diminuindo a sensibilidade. As alíquotas devem ser armazenadas a -20 ° C e protegida da luz. Cada amostra, a reação em branco, ou controle necessita de 20 mL do substrato FITC-caseína. Congelamento / descongelamento, bem como vigorosa mistura ou agitação podem fazer com que o FITC a se separar da caseína, resultando em uma maior fundo de leitura e causando menos substrato para estar disponível para a clivagem da protease.

O isotiocianato de fluoresceína (FITC) Controle Solution-FITC O controle pode ser reconstituída em Tampão de Ensaio para a concentração adequada. Esta solução deve ser feita fresco e protegido da luz.

Final da Solução de Controle Tripsina - Adicione 100 ml de HCl 1 mM para o frasco de tripsina, protease Control (Código do Produto T 6567). Misture rapidamente para garantir a tripsina é dissolvido. Adicionar 900 l do tampão de incubação e misture bem. Alternativamente, buffers podem ser utilizados outros se desejado para o ensaio. A concentração final de trabalho da tripsina é de 20 mg / mL. Quando estiver pronto para preparar a Solução de Controle Tripsina, combine uma alíquota da solução de tripsina ácidos com a quantidade correta do tampão de incubação (1 tripsina acidificados parte para nove partes de buffer). Armazenar a tripsina em meio ácido aumenta a estabilidade da tripsina. A solução de controle de tripsina é sensível à temperatura e não é estável em baixas concentrações.
Reveja boletim técnico do kit para armazenamento e estabilidade destas soluções preparadas.

Procedimento

É mais fácil preparar controles, blanks, e amostras de uma só vez. Para cada amostra, adicionar 20 mL de tampão de incubação, 20 l de FITC-caseína de substrato, e 10 ml da amostra para um tubo de microcentrífuga. Para amostras com atividade de protease alto, diluição da amostra pode ser necessária.
Prepare amostras de controlo adequado (ver amostras de controle), adicionando 20 l de tampão de incubação, 20 l de FITC-caseína de substrato, e 10 ml da amostra de controlo a um tubo de microcentrífuga.
Prepare uma amostra em branco, adicionando 20 l de tampão de incubação, 20 l de FITC-caseína de substrato, e 10 ml de água ultrapura para um tubo de microcentrífuga.
Homogeneizar cada tubo e incubar a 37 ° C no escuro por 60 minutos. Tenha cuidado para não misturar muito vigorosamente, como turbulência excessiva pode causar fundo de fluorescência de alta e reduzir a sensibilidade do ensaio.
Nota: O tempo de incubação pode ser prolongado até 24 horas para aumentar a sensibilidade. Tenha cuidado para não exceder as 24 horas como o FITC-caseína podem começar a se degradar, levando ao fundo de fluorescência de alta.
Após a incubação adicionar 150 mL da solução de ácido 0,6 N tricloroacético a cada tubo de microcentrífuga. TCA é muito corrosivo e deve ser tratado enquanto usava o equipamento de protecção adequado.
Homogeneizar e incubar a 37 ° C no escuro por 30 minutos.
Centrifugue os tubos durante 10 minutos a 10.000 x g. O sobrenadante contém o ácido solúvel, FITC fragmentos rotulados e é utilizado para a medição de fluorescência.

Medidas de fluorescência

Estes métodos podem ser ampliados ou reduzidos de acordo com os requisitos da instrumentação disponível. Para comparação com uma curva padrão preparada com as amostras de controlo adequadas, subtrair a leitura de fluorescência da amostra em branco (FLUblank) do valor de cada amostra (FLUtest).

Cubetas

Pipetar 10 mL do sobrenadante (passo 7) e 1 ml de Tampão de Ensaio numa cuvete adequado e misture delicadamente. Nota: A solução de Tampão de Ensaio sobrenadante e podem ser armazenadas no escuro a 2-8 ° C por até 24 horas antes de medir a fluorescência.
Registrar a intensidade de fluorescência com excitação em 485 nm e monitoramento do comprimento de onda de emissão de 535 nm.

Placas com vários poços

Pipetar 10 mL do sobrenadante Nota (passo 7) e 1 ml de Tampão de Ensaio em um tubo ou frasco adequado e misture delicadamente: A solução de Tampão de Ensaio sobrenadante e podem ser armazenadas no escuro a 2-8 ° C por até a 24 horas antes de medir a fluorescência.
Transferência de 200 mL para um poço de uma placa de 96 preto também. Registrar a intensidade de fluorescência com excitação em 485 nm e monitoramento do comprimento de onda de emissão de 535 nm.
Ou

Pipetar 2 mL do sobrenadante (etapa 7) e 200 mL do B Assayuffer em um poço de uma placa de 96 preto também. Nota: A solução de Tampão de Ensaio sobrenadante e podem ser armazenadas no escuro a 2-8 ° C por até 24 horas antes de medir a fluorescência.
Registrar a intensidade de fluorescência com excitação em 485 nm e monitoramento do comprimento de onda de emissão de 535 nm.

As amostras de controle

A Solução de Controle de tripsina pode ser usado para confirmar o teste está funcionando adequadamente, para determinar o limite de detecção, ou criar uma curva de norma geral. Para o ensaio de uma protease, diferentes específico, recomenda-se para preparar uma solução de controle que contém a protease específica no buffer de incubação apropriado.

O limite de detecção do ensaio é a quantidade de protease, que produz uma leitura significativa de fluorescência acima do valor obtido com a amostra em branco. O limite de detecção irá variar dependendo da sensibilidade dos instrumentos. Diluições seriadas da Solução de Controle Tripsina pode ser usado para gerar as soluções controle.

A leitura igual a 120% do valor obtido com a amostra em branco é considerado significativo. Rotineiramente, um limite de detecção de 5 ng de tripsina foi obtida com este procedimento. Recomenda-se que pelo menos um 5 ng controle de tripsina ser executado a cada ensaio. A solução de controle de tripsina com uma concentração de 0,5 mg / ml resultaria na desejado 5 ng de tripsina no ensaio. A diluição de 40 vezes da Solução de Controle de tripsina (20 mcg / ml) resulta em uma solução de controle de 0,5 ug / ml, ou seja, uma parte da solução de tripsina de controle para 39 partes de tampão de incubação.

Figura 1 (curva padrão de atividade de tripsina): A Solução de Controle Tripsina (20 mcg / ml) também pode ser usado para gerar uma curva padrão, fazendo diluições em série (ver Figura 1). A leitura de fluorescência de cada amostra de controlo foi corrigido subtraindo-se a leitura de fluorescência da amostra em branco (FLUblank) do valor de cada amostra de controlo (FLUcontrol).

Curva padrão típico de tripsina (Product Code T 6567) utilizando este kit e amostras de controle que varia de 0,15 mg / ml (1,5 ng) a 2,5 mg / ml (25 ng). Esta curva foi gerada através do procedimento descrito, com um tempo de incubação de 30 minutos para a etapa 4. Medições de fluorescência foram feitos em uma placa com vários poços.

Isotiocianato de fluoresceína é fornecido como um controle de calibração de instrumentos possíveis (ver instruções do fabricante apropriado) ou determinação da faixa de linearidade do sinal de FITC.

Discussion

Temos mostrado apenas um ensaio exemplo usando o Kit de Detecção de Protease fluorescente para detectar atividade de protease em uma amostra biológica. Este kit foi otimizado para detectar uma gama diversificada de proteases encontrados em aplicações fisiológicas. Ele é adequado para a detecção de cisteína, serina, metalo e proteases aspártico, no entanto, modificações podem ser necessários para detectar alguns proteases específicas.