Summary
Протеазы Флуоресцентный Kit Обнаружение предназначен для измерения активности протеазы использованием флуорометрии. Он также пригоден для обнаружения следовых количеств протеазы загрязнения. Метод основан на протеолитических hydroysis из собственной разработки из FITC-меченого субстрата казеина.
Abstract
Протеазы Флуоресцентный Kit Обнаружение предоставляет готовые к использованию реагенты для обнаружения присутствия протеазы деятельности. Этот простой анализ для выявления активности протеазы используют казеин, меченных флуоресцентной изотиоцианат (FITC) в качестве субстрата.
Активность протеазы приводит к расщеплению FITC-меченого субстрата казеина на более мелкие фрагменты, которые не осадок в кислой среде. После инкубации образца протеазы и субстрата, реакции подкисляют добавлением трихлоруксусной кислоты (TCA). Затем смесь центрифугируют с непереваренной подложки формирования гранул и меньшим, кислоторастворимые фрагментов, оставшихся в растворе. Супернатант нейтрализуют и флуоресценции FITC-меченого фрагмента измеряется.
Описанного комплекта процедура определяет, трипсина контроль протеазы в концентрации примерно 0,5 мкг / мл (5 нг трипсина добавляется анализ). Эта чувствительность может быть увеличена с более длительным временем инкубации, до 24 часов. Анализ выполняется в микроцентрифужных труб и процедуры предназначены для обнаружения флуоресценции с использованием либо кювет или многоямного пластин.
Protocol
Подготовка инструкций
Инкубационный Buffer, буфер, и 0,6 N TCA решения поставляются в виде готовых к использованию решений.
FITC-казеина Субстрат - Рекомендуется аликвоту FITC-казеина субстрата в меньших объемах по прибытии, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. Если FITC-казеина субстрат подвергается повторному циклов замораживания-оттаивания, небольшое увеличение фона будет происходить, тем самым, снижая чувствительность. Аликвоты должны храниться при температуре от -20 ° C в защищенном от света. Каждый образец, пробел или контрольной реакции требуется 20 мкл FITC-казеина субстрата. Замораживания / оттаивания, а также интенсивного перемешивания или взбалтывания может вызвать FITC отделиться от казеина приводит к более высокому фоне чтения и вызывает меньше подложки, будут доступны для протеазы расщепления.
Изотиоцианата флуоресцеина (FITC) Контрольный раствор-FITC управления может быть воссоздана в буфере до соответствующей концентрации. Это решение должно быть свежим и защищенном от света месте.
Заключительное решение Трипсин управления - Добавить 100 мкл 1 мМ раствора для флакон трипсина, протеазы управления (Код продукта T 6567). Смешайте кратко обеспечить трипсина не растворится. Добавить 900 мкл инкубационного буфера и хорошо перемешать. Кроме того, другие буферы могут быть использованы при необходимости для анализа. Окончательный рабочий концентрации трипсина составляет 20 мкг / мкл. Когда все будет готово для подготовки решения Трипсин управления, объединить аликвоты кислотного раствора трипсина с правильным количеством Инкубационный буфер (1 часть подкисленной трипсина до 9 буфера части). Хранение трипсина в кислой среде увеличивает стабильность трипсина. Решение трипсина управления чувствительны к перепадам температур и не является стабильной при низких концентрациях.
Пожалуйста, ознакомьтесь технический бюллетень комплекта для хранения и стабильность этих подготовленных решений.
Процедура
- Проще всего готовить управления, бланки и образцы всех в одно время. Для каждого тестового образца, добавить 20 мкл инкубационного буфера, 20 мкл FITC-казеина основания и 10 мкл исследуемого образца к микроцентрифужных трубки. Для образцов с высокой активностью протеаз, разведения образцов может потребоваться.
- Подготовка соответствующих контрольных проб (см. контрольные образцы), добавляя 20 мкл инкубационного буфера, 20 мкл FITC-казеина основания и 10 мкл контрольного образца для микроцентрифужных трубки.
- Приготовьте чистый образец путем добавления 20 мкл инкубационного буфера, 20 мкл FITC-казеина основания и 10 мкл воды высокой степени очистки, чтобы микроцентрифужных трубки.
- Аккуратно перемешайте каждую пробирку и инкубировать при 37 ° С в темноте в течение 60 минут. Будьте осторожны, чтобы не смешивать слишком энергично, как чрезмерное турбулентности может привести к высокой флуоресценции фон и снижают чувствительность теста.
Примечание: Время инкубации может быть продлен до 24 часов, чтобы увеличить чувствительность. Будьте осторожны, не превышает 24 часов, как FITC-казеина, возможно, начнут деградировать, что приводит к высокой флуоресценции фон. - После инкубации добавить 150 мкл 0,6 N раствора кислоты трихлоруксусной каждому микроцентрифужных трубки. TCA очень агрессивных и должны быть обработаны во время ношения соответствующие средства защиты.
- Аккуратно перемешать и инкубировать при 37 ° С в темноте в течение 30 минут.
- Центрифуги трубы в течение 10 минут при 10000 х g. Супернатант содержит растворимые кислоты, FITC меченых фрагментов и используется для измерения флуоресценции.
Измерения флуоресценции
Эти методы могут быть расширены или вниз в соответствии с требованиями приборы доступны. Для сравнения в стандартной кривой, полученной с соответствующих контрольных проб, вычесть флуоресценции чтение пустой образца (FLUblank) от стоимости каждого опытного образца (FLUtest).
Кюветы
- Внесите 10 мкл надосадочной (шаг 7) и 1 мл буфером в подходящий кювет и аккуратно перемешать. Примечание: решение буфера супернатант и Пробирной может храниться в темноте при температуре 2-8 ° С в течение 24 часов до измерения флуоресценции.
- Запись интенсивность флуоресценции при возбуждении на 485 нм и мониторинга выбросов длиной волны 535 нм.
Многоямного Плиты
- Внесите 10 мкл надосадочной (шаг 7) и 1 мл буфером в подходящую трубу или флакон и аккуратно перемешать Примечание: решение буфера супернатант и Пробирной может храниться в темном месте при температуре 2-8 ° С не более 24 часа до измерения флуоресценции.
- Передача 200 мкл на лунку черный 96 ячейках. Запись интенсивность флуоресценции при возбуждении на 485 нм и мониторинга выбросов длиной волны 535 нм.
Или
- Внесите 2 мкл надосадочной (шаг 7) и 200 мкл Пробирной Buffer в колодец из черного 96 ячейках. Примечание: решение буфера супернатант и Пробирной может храниться в темноте при температуре 2-8 ° С в течение 24 часов до измерения флуоресценции.
- Запись интенсивность флуоресценции при возбуждении на 485 нм и мониторинга выбросов длиной волны 535 нм.
Контрольные образцы
Решение Трипсин управления могут быть использованы для подтверждения анализа выполняет должным образом, для определения предела обнаружения, или создать общий стандарт кривой. Для анализа из различных, специфических протеаз, рекомендуется подготовить контроль раствор, содержащий конкретные протеазы в соответствующий буфер инкубации.
Предел обнаружения анализа является количество протеаз, который производит значительную флуоресценции значения выше значения, полученного с пустыми образца. Предел обнаружения будет варьироваться в зависимости от чувствительности приборов. Серийные разведения раствора трипсина управления может быть использован для создания контрольных растворов.
Чтения равна 120% от величины, полученной с пустой образец считается значительным. Регулярно, предел обнаружения 5 нг трипсина был получен с этой процедурой. Рекомендуется, чтобы по крайней мере одна 5 нг трипсина контроль запуска каждого теста. Решение трипсина управления с концентрацией 0,5 мкг / мл приведет к желаемой 5 нг трипсина в анализе. 40-кратного разбавления раствора трипсина управления (20 мкг / мл) приводит к 0,5 мкг / мл контрольного раствора, т.е. одна часть трипсина контрольного раствора до 39 частей инкубационного буфера.
Рисунок 1 (стандартная кривая активности трипсина): Решение Трипсин управления (20 мкг / мл), также могут быть использованы для создания калибровочной кривой, делая последовательные разведения (см. Рисунок 1). Флуоресценции чтения каждого контрольного образца была исправлена путем вычитания флуоресценции чтение пустой образца (FLUblank) от стоимости каждого контрольного образца (FLUcontrol).
Типичные стандартной кривой для трипсина (код продукта T 6567), используя этот комплект и контрольные образцы в диапазоне от 0,15 мкг / мл (1,5 нг) до 2,5 мкг / мл (25 нг). Эта кривая была создана, следуя описанной процедуре, при времени инкубации 30 минут на шаге 4. Флуоресценция Измерения проводились в пластине многоямного.
Fluorescein изотиоцианата предоставляется в качестве контроля для возможной калибровка прибора (см. инструкции соответствующего производителя) или определения линейности спектра FITC сигнала.
Discussion
Мы только что показали пример методом с использованием протеазы Флуоресцентный Kit Обнаружение обнаружить протеазы деятельности в биологической пробе. Этот комплект был оптимизирован для обнаружения разнообразных протеаз найти в физиологических приложений. Она подходит для обнаружения серин, цистеин, металло и аспарагиновой протеазы, однако изменения могут быть необходимы для выявления некоторых специфических протеаз.
Disclosures
Автор является сотрудником Sigma Aldrich, который производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Fluorescent Detection Kit | Sigma-Aldrich | PF0100 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H1758 |
References
- Twining, S. S. Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes. Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).
