إعداد وثقافة Explants لنس الجرذ طلائي لدراسة التمايز الطرفية

Summary

Explants في المنطقة الوسطى من الفئران عدسة ظهائر التفريق بشكل متزامن عند تربيتها في حضور FGF - 2. يمكن المجهري المناعي من مثل هذه الثقافات يوفر معلومات حول رواية التعبير الجيني والأحداث المرتبطة يشير التمايز المحطة.

Abstract

ويغطي السطح الأمامي للعدسة العين عن طريق أحادي الطبقة من الخلايا الطلائية ، والتي تتكاثر في منطقة الحلقي الكامنة في الجسم الهدبي. بعد التقسيم ، وهذه الخلايا تهاجر الخلف ، حيث نشرها جمعية جيل المستقبل من الشبكية يدفعهم للتمييز في مجموعة الخلفي ممدود من خلايا ألياف العدسة ، الذي يؤلف الجزء الأكبر من العدسة. يمكن أن يتسبب تمايز الخلايا الظهارية في ألياف العدسة عدسة في المختبر بواسطة explants زراعة في المنطقة الوسطى من الظهارة الأمامية في حضور FGF - 2. مستعدون Explants من العدسات من الفئران حديثي الولادة عن طريق إزالة العدسة من العين واستيعاب كبسولة العدسة على الجانب الخلفي مع ملاقط تشريح. ومن ثم الكبسولة الخلفي مزقتها بلطف فتح وضغط أسفل إلى أسفل من البلاستيك طبق نسيج الثقافة. يتم إزالة المناطق المحيطية من يزدرع مع مشرط ومثقف ثم المنطقة الوسطى في حضور 100ng/ml FGF - 2 لطالما 2-3 أسابيع ، اعتمادا على المعلمات لدراستها. منذ الخلايا الظهارية في explants مثقف التفريق في التزامن التقريبي على مدى أيام وأسابيع ، يمكن تحديد مسار وقت الإشارات والتعبير الجيني باستخدام التقنيات الجزيئية والكيمياء الحيوية والدوائية. المجهري المناعي هو مساعدا قويا إلى هذه الأساليب لأنها تدل على توطين التحت خلوية من البروتينات من الاهتمام ويمكن أن تكشف عن الآثار الفسيولوجية للتلاعب التجريبي لمسارات الإشارات.

Protocol

الجزء 1 : إزالة العدسات

المواد والكواشف :

1. الجزئي تشريح مقص ، منحنية ، نصائح صريحة ، (مثل as.RS - 5983 ، Roboz الجراحية المحدودة الصك ، المؤتمر الوطني العراقي ، غايثرسبيرغ ، MD) ؛ الدقيقة تشريح الملقط ، غيض المنحني (مثل Roboz RS5137 #).
2. تعليق المتوسطة : متوسطة تحتوي على 199 0.1 ٪ ألبومين المصل البقري ، و 100 وحدة / مل البنسلين ، 100μg/ml الستربتوميسين ، و 2.5 ميكروغرام / مل الكواشف الامفوتريسين باء متاحة من Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا.

الإجراء :

1. الموت ببطء الفئران حديثي الولادة (الذين تتراوح أعمارهم بين 2-4 أيام) وفقا للمبادئ التوجيهية التي تقدمها المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، دكتوراه في الطب.
2. إزالة الجفون مع مقص جراحي. اضغط بلطف مع ملاقط منحنية على جانبي تجويف العين إلى العين إلى قوة انتفاخ في الخارج. إجراء شق صغير في الجانب الخلفي من العين مع المقص. بالضغط مع ملاقط ضد الجانب المعاكس للعين الشق ، يمكن عندئذ العدسة وكمية صغيرة من الجسم الزجاجي المرفقة ستضطر من خلال تمزق ، مما يسمح التقطت عدسة مع ملاقط منحنية. وينبغي الحرص على عدم الخروج من كبسولة العدسة.
3. استخدام ملاقط منحنية لنقل عدسات ل60mm البلاستيكية التي تحتوي على نسيج الثقافة طبق 5ml الدافئة والمتوسطة تعليق العقيمة.

الجزء 2 : Microdissection من explants

المواد والكواشف :

1. تشريح الملقط الصغير ، نصائح 0.1 ملم ، (مثل Roboz RS - 4976). نحن نستخدم السبائك Dumostar بسبب مرونة من طرف ، ولكن سبائك الصلب الأخرى مقبولة أيضا. لا ينصح ملاقط مع نصائح أرق من 0.1mm ، كما أنها تميل إلى كسر أو الانحناء أثناء هذا الإجراء.
2. تعليق المتوسطة (انظر الجزء 1)
3. Unsupplemented هام لF12 متوسطة أو متوسطة 199 (Invitrogen ، Carlsburg ، CA)

الإجراء :

1. وينبغي القيام بالخطوات التالية في بيئة نظيفة وخالية في مشروع باستخدام أدوات معقمة تشريح والمتوسطة العقيمة.
2. باستخدام مجهر ستيريو تشريح ، وتنظيف العدسات من أي نسيج الانضمام مع ملاقط 0.1 ملم طرف ونقلها إلى طبق الثقافة 60mm ثانية تحتوي على 5ml المتوسطة تعليق العقيمة (هذه الخطوة تساعد على الحد من التلوث). مع ملاقط ، ونقل العدد المرغوب فيه من العدسات لصحن يحتوي على ثقافة 35mm 5ml عقيمة ، unsupplemented المتوسطة. (ونحن غالبا ما تستخدم F12 هام ل(Invitrogen) لهذه الخطوة ، وذلك لأن انخفاض تركيز الصبغة يجعل تشريح أسهل ، ولكن متوسط ​​199 غير مقبولة أيضا ليست هناك حاجة المضادات الحيوية أو إضافات أخرى خلال هذه الخطوة..) والعديد من يمكن إجراء 12 explants في وسط طبق هذا الحجم. ومع ذلك ، ينبغي استخدام طبق 35 ملم حتى لو أقل explants أن تكون المقدمة ، لأنه لا يمكن التلاعب أدوات تشريح بسهولة في أصغر طبق. نقل الطبق الذي يحتوي على عدسات المتبقية لنسيج الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها.
3. التعرف على الجانب الخلفي من العدسة. هناك طرق عديدة لإدراك هذه الحقيقة : 1) والخلفي والأمامي من مستدير ، وهو بالارض قليلا ؛ 2) العدسات الفئران حديثي الولادة شكل إعتام عدسة العين الباردة عندما تبرد إلى درجة حرارة الغرفة أثناء تشريح. إذا ساد الباردة لم تملأ تماما العدسة ، فإن الجانب الخلفي هو الجانب الأبعد من منطقة مبهمة. إذا كان التعتيم قد ملأت العدسة ، والاحترار الطبق الى 37 درجة مئوية لمدة بضع دقائق سيكون عكس ذلك. يمكن التعرف على الجانب الخلفي حيث ساد الإصلاحات على التبريد. 3) يجوز بقايا من الغلالة الوعائية للعدسة تكون مرئية على الجانب الخلفي. 4) يجوز للخياطة الخلفي تكون مرئية على الجانب الخلفي. التعرف على الجانب الخلفي بشكل صحيح أمر أساسي ، لأن هذا هو المكان الذي سيتم فتح الكبسولة. وفتح العدسة على الجانب الأمامي المسيل للدموع على ظهارة.
4. مرة واحدة وقد تم التعرف على الجانب الخلفي ، وتحويلها إلى أعلى وفهم العدسة في ملاقط اليسار (للعامل الحق الوفاض). قرصة ثم الكبسولة الخلفية مع ملاقط الحق في انتاج طية صغيرة.
5. في حين عقد الكبسولة الخلفية مع ملاقط الحق ، فهم حظيرة كبسولة مع ملاقط اليسار وسحب اثنين من أزواج ملاقط في اتجاهين معاكسين لجعل المسيل للدموع صغيرة في الكبسولة.
6. بينما يمسك حافة الكبسولة التراجع مع ملاقط ، تسحبه إلى الأسفل ، أولا على جانب واحد ، ثم من ناحية أخرى ، والضغط عليه في طبق من البلاستيك مع ملاقط. كرر هذا عدة مرات ، وتتحرك في جميع أنحاء خط الاستواء من العدسة ، حتى يرد بحزم الكبسولة الى لوحة في العديد من النقاط. عقد الكبسولة في المكان مع ملاقط اليسار ، الصخرة بلطف كتلة الألياف مع ملاقط الحق في كسر مرفق بين الألياف والخلايا الظهارية خلايا العدسة عند خط الاستواء. ثم دفع كتلة الألياف بعيدا ، المتداول تشغيله الكبسولة / ظهارة ، التي لا تزال تعلق على الجزء السفلي منالطبق. تستمر هذه العملية مع جميع العدسات في الطبق. إزالة ورفض الجماهير الألياف (أو حفظها مجمدة باعتبارها مصدرا للبروتينات العدسة للدراسات أخرى).

الجزء 3 : Microdissection وثقافة explants المركزية

المواد والكواشف :

1. المتاح مشرط معقم ، # 15 شفرة (سينسيناتي الجراحية المحدودة سينسيناتي ، أوهايو)
2. الفوسفات مخزنة المالحة عقيمة مع الكالسيوم والمغنيسيوم (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا)
3. مستنبت : متوسطة تعليق يحتوي 100ng/ml FGF - 2 (سيغما الدريخ ، وشركة سانت لويس ، MO).

الإجراء :

1. باستخدام مشرط معقم ، وتقليم بعيدا ظهارة الطرفية (PE) ، الذي يحتوي على الخلايا في المراحل الأولى من تمايز (الشكل 1A) ، وترك الساحة المركزية 2.0mm تقريبا على الجانب ، ويتألف من خلايا الظهارية المركزية فقط (م) (الشكل 1B).
2. نقل الطبق الذي يحتوي على explants المركزي الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ومرة واحدة مع من 1ml ، معايرتها الطازجة المتوسطة تعليق (37 درجة مئوية ثاني ، و 5 ٪ _2). هذه يغسل يقلل كثيرا من احتمال حدوث تلوث.
3. إضافة 2mL من مستنبت للحث على تمايز ¹ ، ووضع explants في ترطيب والأنسجة حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2. قد فترات ثقافة تكون قصيرة بقدر بضع ساعات أو لتمديد طالما أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، اعتمادا على المعلمة التي تجري دراستها. وينبغي تغيير كل المتوسطة يومين إلى ثلاثة أيام.

الجزء 4 : حصاد explants لتحليل الأحداث المرتبطة التمايز

1. حصاد explants لتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي

المواد :

1. Microdissecting ملاقط
2. SDS الاحتياطي أو تحلل الحمض النووي الريبي في وقت لاحق.

الإجراء :

1. في نهاية فترة الحضانة ، وإزالة ثقافة المتوسط.
2. باستخدام مجهر ستيريو تشريح ، وتخفيف بلطف على حواف كل ازدراع.
3. رفع كل يزدرع مع ملاقط وتحويلها إلى أنبوب يحتوي على نحو العازلة 100μl تحلل SDS (لتحليل البروتين) أو في وقت لاحق - RNA (الحمض النووي الريبي للتحليل). تستنهض الهمم غيض من ملاقط في الحل لضمان أن لا يزدرع التمسك ملاقط.

2. حصاد explants لالمناعي

المواد والكواشف :

1. الفوسفات مخزنة المالحة مع الكالسيوم والمغنيسيوم (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا)
2. الفوسفات مخزنة المالحة (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا)
3. 4 ٪ بارافورمالدهيد (الاحيائية بوسطن ، ورسستر ، MA)
4. Microdissecting ملاقط
5. مسعور وسم القلم
6. الشرائح الزجاجية المجهر
7. 0.25 ٪ تريتون مخزنة X - 100 في الفوسفات المالحة.

الإجراء :

1. شطف explants فترة وجيزة في برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
2. إصلاح الأنسجة بإضافة بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. إزالة تثبيتي ، واستبدال الفوسفات مخزنة المالحة. explants ثابتة تصبح قاسية نوعا ما ، مما يسمح لهم برفع ونقل إلى شرائح زجاجية للimmunostaining.
4. وضع قطرة صغيرة من برنامج تلفزيوني (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) على الشريحة للمساعدة في موقف الأنسجة ومنع الشباك. باستخدام الملقط microdissecting ، ورفع يزدرع وأدخله في الانخفاض على الشريحة. دون لمس يزدرع ، إزالة السائل بعناية مع فتيلة الورق إلى تسطيح يزدرع على الزجاج والسماح للنسيج في الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 5 دقائق.

الرقم (1) ألف وظهارة المحيطية عن تمايز بروتينات محددة. وكان immunostained يزدرع معروضة للN - كادهيرين مباشرة بعد microdissection. ويعتبر التعبير في مجموعة من الخلايا في البشرة المحيطة ، مشيرا إلى أن الخلايا الموجودة في هذه المنطقة قد بدأت في التفريق. باء يمكن أن خفضت وظهارة هامشية بعيدا لإزالة الخلايا التي تعبر عن N - كادهيرين وغيرها من تمايز بروتينات محددة. في الحلقة الأحمر يمثل الموقع من الخلايا التي تعبر عن N - كادهيرين ، في حين أن مربع صغير المبينة في الرمادي يمثل رباعي للظهارة 1A هو موضح في اللوحة. يمكن إزالة ظهارة الطرفية أربعة تخفيضات مشرط ، وترك الساحة المركزية التي تحتوي على الخلايا الوحيدة التي لم تبدأ بعد للتمييز.

Discussion

وقد تم ازدراع عدسة نظام الفئران المستخدمة بنجاح من قبل عدد من المختبرات لدراسة محطة تمايز الخلايا الظهارية للألياف العدسة عدسة ^21،3،4،5. عندما تتعرض لجمعية جيل المستقبل - 2 في 100ng/ml سوف تبدأ explants لإظهار التغيرات في الإشارة في غضون دقائق ⁶ ، مع تغييرات في الشكل والتعبير الجيني التي تظهر تباعا على مدى عدة أيام ^3،4،5. ثقافات تبقى قابلة للحياة لمدة 2-3 أسابيع إذا كان الحرص على منع التلوث.

وexplants المركزية الموصوفة في هذا البروتوكول مفيدة بوجه خاص لدراسة تسلسل الأحداث المرتبطة تمايز ، لأنها تحتوي على بعض الخلايا التي وجدت التعبير عن علامات التمايز قبل FGF - 2 يضاف ^1،5. ثم تمييز الخلايا بشكل متزامن ، وأتراب ، مما يجعل من الممكن لمتابعة دوام من الإشارات والأحداث المرتبطة الترانسكربتي التمايز. explants زراعة لفترات مختلفة من الوقت وبالتالي يوفر معلومات دقيقة عن الزماني للأحداث التسلسل. ويمكن إضافة مثبطات محددة إلى مستنبت ذات الصلة لتحديد مسارات الإشارات. يمكن استخدامها لتحليل التعبير Explants البروتين هلام إستشراد SDS وimmunoblotting أو لتحليل التعبير عن mRNAs محددة RT - PCR. بروتين غلة تتراوح 20-50 ميكروغرام / يزدرع والمحصول RNA هو حوالي 200 -- 600 نانوغرام / يزدرع ، تبعا لطول فترة الثقافة. عموما نجد أن explants 5-6 في صحن سيوفر البروتين كافية أو الحمض النووي الريبي لفحوصات عدة. ويمكن أيضا من الحمض النووي الريبي explants أن تستخدم لإعداد [كدنا] لتقييم التعبير الجيني عن طريق التحليل ميكروأري ، والتي يمكن تحديد جينات جديدة قد تكون حاسمة للتمايز. ويمكن أيضا أن تكون Explants transfected. على الرغم من كفاءة ترنسفكأيشن منخفضة عموما ، فإنه يكفي لمعايرة الجينات مراسل ^{4 و 7 و 8.} المجهري المناعي للexplants يقدم إضافة مفيدة لأساليب الكيمياء الحيوية من خلال تحديد مكان التحت خلوية من البروتينات المثيرة للاهتمام. وبالتالي ، فإن إعداد وثقافة explants عدسة الفئران نظاما قويا لدراسة عدسة محطة تمايز في الثدييات ، والتي يمكن أن تكمل في تقنيات الحية ، مثل جيل من الفئران المعدلة وراثيا وضرب.