Vorbereitung und Kultur der Rat Linsenepithelzellen Explantate für ein Studium der terminalen Differenzierung

Summary

Explantate der zentralen Region von Ratten Objektiv Epithelien synchron zu unterscheiden, wenn in Gegenwart von FGF-2 kultiviert. Immunfluoreszenzmikroskopie solcher Kulturen stellt neue Informationen über Genexpression und Signaltransduktion mit der terminalen Differenzierung verbunden.

Abstract

Die vordere Fläche der Augenlinse wird durch eine Monolage von Epithelzellen, die in einer ringförmigen Zone zugrunde liegenden Ziliarkörper vermehren abgedeckt. Nach Division, diese Zellen nach hinten wandern, wo FGF diffundieren aus der Retina induziert sie in eine hintere Reihe von länglichen Linse Faserzellen, die den Großteil der Linse komponieren zu unterscheiden. Die Differenzierung der Linsen-Epithel-Zellen in Linsenfasern kann in vitro durch Kultivierung von Explantaten der zentrale Bereich des vorderen Epithels in Gegenwart von FGF-2 induziert werden. Explantate aus Linsen neugeborenen Ratten durch das Entfernen der Linse aus dem Auge und Greifen der Linsenkapsel an der hinteren Seite mit Sezieren einer Pinzette vorbereitet. Die hintere Kapsel wird dann vorsichtig aufgerissen und ab in die Kunststoff-Unterseite eines Gewebes Kulturschale gedrückt. Die peripheren Regionen der Explantation sind mit einem Skalpell entfernt und der zentrale Bereich wird dann in Anwesenheit von 100ng/ml FGF-2, solange 2-3 Wochen kultiviert, abhängig von der zu untersuchenden Parameter. Da Epithelzellen in kultivierten Explantate in annähernd synchron zu differenzieren über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen kann der zeitliche Verlauf der Signalisierung und die Genexpression anhand molekulare, biochemische und pharmakologische Techniken. Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Ergänzung zu diesen Methoden, wie sie die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen von Interesse zeigt, und können die physiologischen Folgen der experimentellen Manipulationen der Signalwege zu offenbaren.

Protocol

Teil 1: Entfernen von Objektiven

Materialien und Reagenzien:

1. Micro-Präparierscheren, gekrümmte, stumpfe Spitzen, (wie as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD), Mikro-Sezieren Pinzette, gebogene Spitze (wie Roboz # RS5137).
2. Suspensionsmedium: Medium 199 mit 0,1% Rinderserumalbumin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100μg/ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B. Die Reagenzien sind von Invitrogen, Carlsbad, CA zur Verfügung.

Vorgehensweise:

1. Euthanize neugeborenen Ratten (Alter 2-4 Tage) in Übereinstimmung mit den Richtlinien von den National Institutes of Health, Bethesda, MD zur Verfügung gestellt.
2. Entfernen Sie die Augenlider mit chirurgischer Schere. Drücken Sie vorsichtig mit gebogenen Pinzette auf den gegenüberliegenden Seiten der Augenhöhle auf das Auge zu wölben nach außen gerichtete Kraft. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der hinteren Seite des Auges mit der Schere. Durch Drücken mit der Pinzette an der Seite des Auges gegenüber dem Schnitt kann das Objektiv und eine kleine Menge der angeschlossenen Glaskörper dann durch den Bruch erzwungen werden, so dass das Objektiv mit gebogenen Pinzette abgeholt werden. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Linsenkapsel zu brechen.
3. Verwenden Sie die gebogene Pinzette, um die Linsen zu einem 60mm Kunststoff Gewebekultur Schale mit 5 ml warme, sterile Suspension Medium zu übertragen.

Teil 2: Mikrodissektion von Explantaten

Materialien und Reagenzien:

1. Micro Dissecting Pinzette, 0,1 mm Spitzen, (wie Roboz RS-4976). Wir verwenden Dumostar Legierung wegen der Flexibilität der Spitze, aber auch andere Stahllegierungen sind auch akzeptabel. Pinzetten mit Spitzen dünner als 0,1 mm sind nicht empfehlenswert, da sie zu brechen oder während dieses Vorgangs Kurve neigen.
2. Suspensionsmedium (siehe Teil 1)
3. Unsupplementierte Ham 's F12 Medium oder Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)

Vorgehensweise:

1. Die folgenden Schritte sollten in einem sauberen, zugfreien Umgebung mit sterilen Sezieren Werkzeuge und sterile Medium durchgeführt werden.
2. Mit einem Stereo-Binokular, reinigen Sie die Linsen eventuell anhaftende Gewebe mit der 0,1 mm Spitze Pinzette und übertragen Sie sie auf eine zweite 60mm Kulturschale mit 5 ml sterile Suspensionsmedium (dieser Schritt hilft, zur Verringerung der Kontaminierung). Mit der Pinzette, übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Linsen zu einer 35-mm Kulturschale mit 5 ml sterile, unsupplementierte Medium. (Wir verwenden oft Ham 's F12 (Invitrogen) für diesen Schritt, weil die untere Farbstoffkonzentration macht Dissektion leichter, jedoch ist Medium 199 auch akzeptabel Keine Antibiotika oder andere Zusätze in diesem Schritt benötigt werden..) Bis zu 12 Explantate gemacht werden können in der Mitte eines Tellers dieser Größe. Allerdings sollte eine 35 mm-Schale verwendet, auch wenn weniger Explantate gemacht werden, da die Zerlegung-Werkzeuge können nicht einfach in eine kleinere Schüssel manipuliert werden sollen. Übertragen Sie die Schale mit den restlichen Linsen zu einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, bis sie benötigt werden.
3. Identifizieren der hinteren Seite der Linse. Es gibt viele Wege, dies zu erkennen: 1) Die hintere ist runder als die vorderen, die leicht abgeflacht ist, 2) neugeborenen Ratte Linsen bilden kalte Grauen Star, wie sie auf Raumtemperatur abkühlen während der Präparation. Wenn die kalte Grauen Star hat nicht ganz die Linse gefüllt ist, wird die hintere Seite die Seite aus dem opaken Bereich am weitesten. Wenn Sie die Deckkraft hat die Linse gefüllt, Erwärmung der Schüssel auf 37 ° C für ein paar Minuten wird es umgekehrt. Die hintere Seite kann als die Katarakt-Reformen beim Abkühlen identifiziert werden. 3) Spuren der Tunica vasculosa lentis kann sichtbar auf der hinteren Seite. 4) Die hintere Naht sichtbar sein an der hinteren Seite. Die Ermittlung der hinteren Seite korrekt ist wichtig, da hier die Kapsel geöffnet werden. Eröffnung der Linse auf der Vorderseite reißt das Epithel.
4. Sobald der hinteren Seite identifiziert worden ist, schalten Sie ihn nach oben und greifen die Linse in der linken Pinzette (für einen Rechtshänder Arbeiter). Dann klemmen Sie das hintere Kapsel mit der rechten Pinzette, eine kleine Falte zu erzeugen.
5. Halten Sie die hintere Kapsel mit der rechten Pinzette fassen die Falte der Kapsel mit der linken Pinzette und ziehen Sie die beiden Pinzetten in entgegengesetzte Richtungen, um einen kleinen Riss in der Kapsel zu machen.
6. Fassen Sie den Rand des Zurückziehen Kapsel mit der Pinzette, ziehen Sie es nach unten, zuerst auf der einen Seite, dann auf der anderen, Einpressen in den Kunststoff der Schale mit der Pinzette. Wiederholen Sie dies einige Male, bewegt rund um den Äquator der Linse, bis die Kapsel ist fest mit der Platte an vielen Stellen angebracht. Halten Sie die Kapsel in Ort mit der linken Pinzette, schaukeln die Fasermasse mit der rechten Pinzette die Bindung zwischen der Faser und Epithelzellen an der Linsenäquator brechen. Dann drücken Sie die Fasermasse entfernt, rollt ihn aus der Kapsel / Epithel, das an der Unterseite der bleibtGericht. Setzen Sie diesen Vorgang mit allen Objektiven in die Schüssel. Entfernen und Entsorgen der Fasermassen (oder speichern Sie sie als eine Quelle der Linsenproteinen für weitere Untersuchungen eingefroren).

Teil 3: Mikrodissektion und Kultur von zentraler Explantate

Materialien und Reagenzien:

1. Sterile Einweg-Skalpell Nr. 15 Klinge, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH)
2. Sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Kulturmedium: Suspension Medium mit 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO).

Vorgehensweise:

1. Mit einem sterilen Skalpell, wegschneiden der peripheren Epithel (PE), die Zellen enthält in den frühen Stadien der Differenzierung (Abbildung 1A), so dass ein zentraler Platz ca. 2,0 mm auf einer Seite, bestehend aus zentralen Epithelzellen nur (CE) (Abbildung 1B).
2. Übertragen Sie die Schale mit dem zentralen Explantate eine Biosicherheitswerkbank. 3 x waschen mit sterilem PBS mit Calcium und Magnesium und einmal mit 1 ml frisch, äquilibriert (37 ° C, 5% CO ₂₎ Suspensionsmedium. Diese wäscht erheblich reduzieren die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination.
3. Add 2 ml Kulturmedium zu einer Differenzierung ^{1 zu} induzieren, und legen die Explantate in einem befeuchteten, Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2. Kultur Perioden kann so kurz wie ein paar Stunden oder zu verlängern, solange zwei vor drei Wochen, je nach Parameter untersucht. Medium sollte alle zwei vor drei Tagen sein.

Teil 4: Die Ernte der Explantate für die Analyse von Ereignissen mit der Differenzierung verbunden

1. Harvesting Explantate für die Analyse von Protein-oder RNA

Materialien:

1. Microdissecting Pinzette
2. SDS-Lysepuffer oder RNA-später

Vorgehensweise:

1. Am Ende der Inkubationszeit, entfernen Sie das Kulturmedium.
2. Mit dem Stereo-Binokular, sanft lockern die Kanten der einzelnen Explantation.
3. Heben Sie jedes Explantat mit der Pinzette und überträgt es auf ein Rohr mit etwa 100 &mgr; SDS Lysepuffer (für Protein-Analyse) oder RNA-später (für RNA-Analyse). Man schüttelt die Spitze der Pinzette in die Lösung, um sicherzustellen, dass die Explantation nicht die Pinzetten-Stick.

2. Harvesting Explantate für Immunfluoreszenz

Materialien und Reagenzien:

1. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (ohne Calcium und Magnesium) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. 4% Paraformaldehyd (Boston Bioproducts, Worcester, MA)
4. Microdissecting Pinzette
5. Hydrophobe Markierstift
6. Glasobjektträger
7. 0,25% Triton X-100 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.

Vorgehensweise:

1. Spülen Explantate kurz in PBS mit Calcium und Magnesium.
2. Fix Gewebe durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie das Fixativ und ersetzen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Feste Explantate werden etwas steif, so dass sie aufgehoben und übertragen werden Glasträger für Immunfärbung.
4. Legen Sie einen kleinen Tropfen PBS (ohne Calcium und Magnesium) auf der Folie in die richtige Position des Gewebes und verhindern, Eisstockschießen. Mit microdissecting Pinzette, heben Sie die Explantation und fügen Sie ihn in die Tropfen auf dem Objektträger. Ohne Berührung der Explantation, entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem Papiertuch Docht auf dem Explantat auf dem Glas flach und lassen das Gewebe trocknen an der Luft bei Raumtemperatur für 3 bis 5 Minuten.

Abbildung 1 A. Die periphere Epithel drückt Differenzierungs-spezifischen Proteinen. Das Explantat gezeigt wurde für N-Cadherin unmittelbar nach Mikrodissektion immungefärbt. Expression ist in einem Band von Zellen im peripheren Epithel zu sehen, was darauf hinweist, dass die Zellen in dieser Region haben damit begonnen, zu unterscheiden. B. Die periphere Epithel weg getrimmt werden kann, um Zellen zu entfernen, die zum Ausdruck N-Cadherin und andere Differenzierungs-spezifischen Proteinen. Der rote Ring steht für die Lage von Zellen, die zum Ausdruck N-Cadherin, während das kleine Quadrat in grau skizzierte die Quadranten des Epithels in Panel 1A gezeigt ist. Die periphere Epithel kann durch vier Skalpell Schnitte entfernt werden, wobei ein zentraler Platz, dass nur Zellen, die noch nicht begonnen haben, zu unterscheiden, enthält.

Discussion

Die Ratte Objektiv Explantation System wurde erfolgreich durch eine Reihe von Labors zur terminalen Differenzierung der Linse Epithelzellen zu Linsenfasern ^21,3,4,5 Studie verwendet. Wenn an FGF-2 bei 100ng/ml ausgesetzt die Explantate werden beginnen, Veränderungen in Signalisierung innerhalb weniger Minuten ⁶ zeigen, mit den Veränderungen in der Morphologie und Genexpression erscheinen nacheinander über mehrere Tage ^3,4,5. Die Kulturen bleiben für 2-3 Wochen lebensfähig, wenn darauf geachtet wird, um eine Kontamination zu verhindern.

Die zentrale Explantate in diesem Protokoll beschriebenen sind besonders nützlich für die Untersuchung der Abfolge der Ereignisse mit der Differenzierung verbunden, da sie wenige oder gar keine Zellen, die Differenzierung Marker vor FGF-2 Express ^1,5 hinzugefügt wird enthalten. Die Zellen werden dann synchron zu differenzieren, wie eine Kohorte, die es ermöglicht, den zeitlichen Verlauf der Signalisierungs-und Transkriptions-Veranstaltungen mit der Differenzierung verbundene folgen. Die Kultivierung Explantate für unterschiedliche Zeitspannen somit genaue zeitliche Informationen über die Reihenfolge Ereignisse. Spezifische Inhibitoren kann zum Kulturmedium zugegeben werden, um relevante Signalwege zu identifizieren. Explantate verwendet werden, um die Proteinexpression durch SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot analysieren oder Expression spezifischer mRNAs mittels RT-PCR analysiert werden. Protein liefert Bereich von 20-50 g / Explantation und RNA-Ausbeute ist etwa 200 bis 600 ng / Explantation, abhängig von der Länge der Kulturzeit. Wir in der Regel feststellen, dass 5-6 Explantate pro Gericht wird ausreichend Protein oder RNA für mehrere Untersuchungen liefern. RNA aus Explantaten kann auch verwendet werden, um cDNA für die Beurteilung der Genexpression durch Microarray-Analyse, die neue Gene, die entscheidend für die Differenzierung kann identifizieren können vorbereitet werden. Explantate können auch transfiziert werden. Obwohl Transfektionseffizienz generell gering ist, genügt es für die Bestimmung von Reportergene ^{4; 7; 8.} Immunfluoreszenzmikroskopie der Explantate bietet eine sinnvolle Ergänzung zu biochemischen Methoden durch die Bestimmung der subzellulären Lokalisation der Proteine ​​von Interesse. Somit stellt die Vorbereitung und die Kultur der Ratte Objektiv Explantate ein leistungsfähiges System für die Untersuchung Terminal Linse Differenzierung bei Säugetieren, die in vivo-Techniken, wie zB Erzeugung von transgenen und knock-out Mäuse ergänzen können.