הכנה והתרבות של עדשה Explants עכברוש אפיתל ללימוד בידול Terminal

Summary

Explants האזור המרכזי של עכברוש העדשה epithelia להבדיל סינכרוני כאשר בתרבית בנוכחות של FGF-2. מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרבויות כאלה יכולים מספק מידע רומן על ביטוי גנים ואירועים איתות הקשורים בידול סופנית.

Abstract

המשטח הקדמי של עדשת העין מכוסה בשכבה של תאים אפיתל, אשר מתרבים באזור טבעתי שבבסיס גוף ריסי. בעקבות החלוקה, תאים אלו נודדים בדיעבד, שם FGF לשדר מן הרשתית גורמת להם להתמיין למגוון האחורי של סיבים מאורכים תאים העדשה, אשר מהווים את חלק הארי של העדשה. התמיינות של תאים אפיתל העדשה לתוך סיבי העדשה יכול להיגרם על ידי במבחנה explants culturing האזור המרכזי של האפיתל הקדמית בנוכחות של FGF-2. Explants מוכנים מן העדשות של חולדות הילוד על ידי הסרת העדשות מהעין ו לתפוס את הקפסולה העדשה בצד האחורי עם פינצטה לנתח. קפסולה אחורית אז הוא נקרע בעדינות לפתוח ולחצתי לתחתית צלחת פלסטיק של תרבית רקמה. אזורי הפריפריה של explant מוסרים עם אזמל והאזור המרכזי בתרבית ואז בנוכחות 100ng/ml FGF-2 עוד 2-3 שבועות, תלוי בפרמטרים כדי להיחקר. מכיוון שתאי האפיתל explants תרבותי להבחין בתיאום המשוער לאורך תקופה של ימים עד שבועות, במהלך תקופה של איתות ביטוי גנים ניתן לקבוע תוך שימוש בטכניקות מולקולריות, ביוכימיות, וגם תרופתי. מיקרוסקופיה immunofluorescence הוא נספח חזק בשיטות אלה כפי שהוא מדגים את subcellular לוקליזציה של חלבונים עניין יכול לחשוף את ההשלכות הפיזיולוגיות של מניפולציות ניסיוני של מסלולי איתות.

Protocol

חלק 1: הסרת עדשות

חומרים ריאגנטים:

1. Micro-לנתח מספריים, מעוקל, טיפים בוטה, (כגון as.RS-5983, Roboz Instrument ושות כירורגי, Inc, Gaithersburg, MD); מיקרו לנתח פינצטה, קצה מעוגל (כגון Roboz # RS5137).
2. בינוני השעיה: בינוני 199 המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור, 100 יחידות / מ"ל ​​לפניצילין, סטרפטומיצין 100μg/ml, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin ריאגנטים ב זמינים Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה.

נוהל:

1. חולדות להרדים תינוק (גילאי 2-4 ימים) בהתאם להנחיות שסופקו על ידי מכוני הבריאות הלאומיים, Bethesda, MD.
2. הסר את העפעפיים עם מספריים כירורגיות. לחצו בעדינות עם פינצטה מעוקל בצדדים מנוגדים של ארובת העין להכריח את העין בליטה החוצה. לעשות חתך קטן בצד האחורי של העין עם המספריים. על ידי לחיצה עם פינצטה על הצד של העין מול החתך, העדשה כמות קטנה של הגוף הזגוגי המצורפת אז יכול להיות כפוי דרך קרע, המאפשר את העדשה להיות הרים עם פינצטה מעוקל. יש להקפיד לא לשבור את הקפסולה העדשה.
3. השתמש פינצטה מעוקל להעביר את העדשות אל צלחת רקמות 60mm פלסטיק תרבות המכילה 5 מ"ל מדיום חם, השעיה סטרילית.

חלק 2: Microdissection של explants

חומרים ריאגנטים:

1. מלקטת הביתור Micro, טיפים 0.1 מ"מ, (כגון Roboz RS-4976). אנו משתמשים סגסוגת Dumostar בגלל הגמישות של קצה, אך פלדה וסגסוגות אחרות יתקבלו אף הן. פינצטה עם עצות יותר רזה 0.1mm אינם מומלצים, כפי שהם נוטים להישבר או להתכופף במהלך הליך זה.
2. השעיה בינוני (ראו חלק 1)
3. Unsupplemented F12 של חם בינוני או בינוני 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)

נוהל:

1. השלבים הבאים צריכים להתבצע סביבה נקייה, גיוס חינם באמצעות כלים לנתח סטרילית בינוני סטרילית.
2. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו לנתח, לנקות את העדשות של רקמה כלשהי דבקות עם פינצטה קצה 0.1 מ"מ ולהעבירם תרבות צלחת שנייה 60mm השעיה המכיל 5 מ"ל בינוני סטרילי (שלב זה עוזר להפחית זיהום). בעזרת הפינצטה, להעביר את המספר הרצוי של עדשות לצלחת תרבות 35mm המכיל 5 מ"ל בינוני סטרילי, unsupplemented. (אנו מרבים להשתמש F12 חם של (Invitrogen) של שלב זה, כי ריכוז לצבוע נמוך עושה דיסקציה קל, אולם בינוני 199 מקובלת גם לא אנטיביוטיקה או תוספות אחרות יש צורך במהלך שלב זה..) רבים כמו 12 explants יכול להתבצע במרכז צלחת בגודל כזה. עם זאת, מנה 35 מ"מ אמור לשמש גם אם הם פחות explants להתבצע, כי את הכלים לנתח לא ניתן להשפיע בקלות בצלחת קטנה יותר. מעבירים את תבשיל המכיל את עדשות הנותרים תרבות רקמות החממה ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים.
3. זהה את הצד האחורי של העדשה. ישנן דרכים רבות להכיר זה: 1) האחורי הוא יותר עגול הקדמי, שהוא שטוח מעט; 2) עדשות עכברוש יילוד טופס קטרקט קר כפי שהם להתקרר לטמפרטורת החדר במהלך הניתוח. אם קטרקט קר לא מילא לגמרי את העדשה, הצד האחורי הוא הצד המרוחק מאזור אטום. אם אטימות מילא את העדשה, מחמם את המנה עד 37 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות זה יהיה הפוך. הצד האחורי ניתן לזהות את הרפורמות קטרקט בקירור. 3) שרידים של Tunica vasculosa lentis יכול להיות גלוי בצד האחורי. 4) תפר אחורי יכול להיות גלוי בצד האחורי. זיהוי הצד האחורי נכונה היא חיונית, שכן זה המקום שבו הקפסולה ייפתח. פתיחת העדשה בצד הקדמי יהיה לקרוע את רקמת האפיתל.
4. ברגע הצד האחורי זוהה, להפוך אותו כלפי מעלה ולתפוס את העדשה ב פינצטה שמאל (לעובד ימניים). אז קמצוץ הקפסולה האחורי עם פינצטה הזכות לייצר קפל קטן.
5. בעוד מחזיק את הקפסולה האחורי עם פינצטה הנכון, לתפוס את קפל של קפסולה עם פינצטה שמאל ולמשוך את שני זוגות פינצטה בכיוונים מנוגדים כדי להפוך דמעה קטנה הקפסולה.
6. בעוד לתפוס את הקצה של הקפסולה retracting עם פינצטה, למשוך אותו כלפי מטה, תחילה בצד אחד, אז בצד השני, הטביע אותו בתוך הפלסטיק של המנה בפינצטה. חזור על פעולה זו מספר פעמים, נע סביב קו המשווה של העדשה, עד הקפסולה מחובר היטב בצלחת בנקודות רבות. החזקת קפסולה במקום עם פינצטה שמאל, בעדינות רוק המוני סיבים עם פינצטה הזכות לשבור את הקשר בין התאים סיבים ותאי אפיתל בקו המשווה את העדשה. ואז לדחוף את המוני סיבים משם, מגלגל אותו הקפסולה / אפיתל, אשר נשאר מחובר לתחתיתצלחת. המשך בתהליך זה עם כל עדשות בצלחת. הסר וזורקים את ההמונים סיבים (או לשמור אותם קפואים מקור חלבונים העדשה למחקרים אחרים).

חלק 3: Microdissection והתרבות של explants המרכזי

חומרים ריאגנטים:

1. באיזמל חד פעמי סטרילי, # 15 להב, (סינסינטי כירורגי ושות סינסינטי, אוהיו)
2. פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה)
3. בינוני תרבות: בינוני השעיה המכיל 100ng/ml FGF-2 (סיגמא אולדריץ, Inc סנט לואיס, מיזורי).

נוהל:

1. באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך אפיתל היקפי (PE), אשר מכיל תאים בשלבים המוקדמים של בידול (איור 1A), משאיר הכיכר המרכזית 2.0mm כ בצד, המורכב מתאי אפיתל מרכזי בלבד (CE) (איור 1B).
2. מעבירים את תבשיל המכיל את explants מרכזי ארון biosafety. לשטוף 3 פעמים עם PBS סטרילי המכיל סידן ומגנזיום ופעם עם 1ml של טרי בינוני, (37 ° C CO, 5% ₂₎ equilibrated ההשעיה. אלו רוחץ לצמצם במידה ניכרת את הסיכוי לזיהום.
3. הוסף 2ml של המדיום תרבות להשרות התמיינות ^1, והמקום explants ב humidified, בתרבית רקמה החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. תקופות תרבות עשוי להיות קצר ככל כמה שעות או להאריך עוד שבועיים עד שלושה שבועות, בהתאם לפרמטר הנלמד. בינוני יש לשנות כל יומיים שלושה.

חלק 4: קצירת של explants לניתוח אירועים בידול

1. Explants מסיק לניתוח של חלבון או רנ"א

חומרים:

1. Microdissecting פינצטה
2. SDS תמוגה חוצץ או RNA-בהמשך

נוהל:

1. בתום תקופת הדגירה, להסיר את המדיום לתרבות.
2. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו לנתח, לשחרר בעדינות את הקצוות של כל explant.
3. הרם כל explant בפינצטה ולהעביר אותו צינור המכיל כ חיץ SDS תמוגה 100μl (לניתוח חלבונים) או RNA, לאחר מכן (לניתוח RNA). להתסיס את קצה של פינצטה בפתרון על מנת להבטיח כי explant אינו מקל על פינצטה.

2. Explants מסיק עבור immunofluorescence

חומרים ריאגנטים:

1. פוספט שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה)
2. פוספט שנאגרו מלוחים (ללא סידן ומגנזיום) (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה)
3. Paraformaldehyde 4% (Bioproducts בוסטון, Worcester, MA)
4. Microdissecting פינצטה
5. עט סימון הידרופובי
6. מיקרוסקופ זכוכית שקופיות
7. 0.25% Triton X-100 ב פוספט שנאגרו מלוחים.

נוהל:

1. לשטוף explants בקצרה PBS המכיל סידן ומגנזיום.
2. תיקון רקמות על ידי הוספת paraformaldehyde 4% במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסר את מקבע ולהחליף פוספט שנאגרו מלוחים. Explants קבוע להיות נוקשה למדי, ומאפשר להם להיות הרים והועברו שקופיות זכוכית immunostaining.
4. המקום טיפה קטנה של PBS (ללא סידן ומגנזיום) בשקופית כדי לסייע למקם את הרקמה ולמנוע מסתלסל. בעזרת פינצטה microdissecting, להרים את explant ו להכניס אותו לתוך הירידה בשקופית. מבלי לגעת explant, להסיר בזהירות את הנוזל עם הפתיל נייר כדי לשטח את explant על הזכוכית ולתת הרקמה יבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 5 דקות.

איור 1 א אפיתל היקפי מבטא ספציפי בידול חלבונים. Explant הראו היה immunostained עבור N-cadherin מיד לאחר microdissection. הביטוי הוא ראה בלהקה של תאים אפיתל הפריפריה, המציין כי תאים באזור זה החלו להבחין. B. אפיתל היקפי יכול להיות trimmed ממנו להסיר תאים המבטאים N-cadherin אחרים ספציפיים בידול חלבונים. Annulus אדום מייצג את המיקום של תאים המבטאים N-cadherin, בעוד ריבוע קטן המתוארים אפור מייצג את רביע של האפיתל המוצג בלוח 1 א. האפיתל היקפי ניתן להסיר על ידי ארבעה חתכים אזמל, משאיר הכיכר המרכזית המכילה תאים בלבד טרם החלו להבחין.

Discussion

העדשה עכברוש מערכת explant שימש בהצלחה על ידי מספר מעבדות מחקר בידול הטרמינל של תאים אפיתל העדשה לסיבי העדשה ^21,3,4,5. כאשר נחשף FGF-2 ב 100ng/ml explants יתחיל להראות שינויים איתות בתוך ⁶ דקות, עם שינויים במורפולוגיה ועל ביטוי גנים המופיעים ברצף במשך כמה ימים ^3,4,5. תרבויות נשארים קיימא עבור 2-3 שבועות אם הטיפול נלקח על מנת למנוע זיהום.

Explants המרכזי המתואר פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור לומדים את רצף האירועים הקשורים הבחנה, מכיוון שהם מכילים מעט אם בכלל תאים המבטאים סמנים בידול לפני FGF-2 הוא הוסיף ^1,5. התאים אז להבדיל סינכרוני, כמו במדגם, כך שניתן לעקוב אחר מהלך הזמן של איתות תעתיק אירועים הקשורים בידול. Explants culturing עבור זמן שונים ובכך מספק מידע מדויק על זמני רצף האירועים. מעכבי ספציפיים ניתן להוסיף בינוני התרבות לזהות איתות המסלולים הרלוונטיים. Explants ניתן להשתמש כדי לנתח את ביטוי החלבון על ידי אלקטרופורזה בג'ל SDS ו immunoblotting או לנתח את הביטוי של mRNAs ספציפי על ידי RT-PCR. התשואות חלבון בטווח 20-50 מיקרוגרם / explant ואת התשואה RNA הוא כ 200-600 ng / explant, בהתאם לאורך התקופה והתרבות. בדרך כלל אנחנו מוצאים 5-6 explants לכל צלחת תספק מספיק חלבון או רנ"א עבור מבחני מספר. RNA מן explants יכול לשמש גם כדי להכין cDNA להערכת ביטוי גנים על ידי ניתוח microarray, אשר יכול לזהות גנים הרומן הזה יכול להיות קריטי עבור בידול. Explants יכול להיות גם transfected. למרות היעילות transfection הוא בדרך כלל נמוך, זה מספיק עבור assaying גנים כתב ^{4, 7, 8.} מיקרוסקופיה immunofluorescence של explants מספק נלווה שימושי בשיטות ביוכימיות על ידי קביעת מיקום subcellular של חלבונים של עניין. לפיכך, הכנת והתרבות של explants העדשה עכברוש מספק מערכת רבת עוצמה ללימוד העדשה בידול מסוף ביונקים, אשר יכול להשלים בטכניקות vivo, כמו הדור של העכברים הטרנסגניים ו עקום החוצה.