Upprättande och kultur Epithelial Råtta Lens explants för att studera terminal differentiering

Summary

Explants av de centrala delarna av råtta lins epitel skilja synkront vid odling i närvaro av FGF-2. Immunofluorescens mikroskopi av sådana kulturer kan ger romanen information om genuttryck och signalering händelser i samband med terminal differentiering.

Abstract

Den främre yta okularlinsen är täckt av ett monolager av epitelceller, som förökar sig i en ringformad zon som ligger bakom ciliarkroppen. Efter division, dessa celler vandrar posteriort, där FGF sprids från näthinnan inducerar dem att differentieras till en bakre rad långsträckta celler lins fiber, som utgör den största delen av linsen. Differentiering av objektiv epitelceller i linsen fibrer kan induceras in vitro genom odling explants av de centrala delarna av den främre epitelet i närvaro av FGF-2. Explants framställs av linser av neonatala råttor genom att ta bort linsen från ögat och ta tag i linskapseln på den bakre sidan med dissekera pincett. Den bakre kapsel är sedan försiktigt slits öppna och trycks ner i plast botten av en vävnadskultur maträtt. Det perifera regioner Explantation tas bort med skalpell och det centrala området är sedan odlade i närvaro av 100ng/ml FGF-2 så länge som 2-3 veckor, beroende på de parametrar som skall studeras. Eftersom epitelceller i odlade explants skilja i ungefärlig synkront över en period av dagar till veckor, kan den tid under signalering och genuttryck bestämmas med hjälp av molekylära, biokemiska och farmakologiska tekniker. Immunofluorescensmikroskopi är ett kraftfullt komplement till dessa metoder eftersom det visar att subcellulära lokalisering av proteiner av intresse och kan avslöja de fysiologiska effekterna av experimentella manipulationer av signalvägar.

Protocol

Del 1: Borttagning av linser

Material och reagens:

1. Micro-dissekera sax, böjda, trubbiga tips, (t.ex. as.RS-5983, Roboz kirurgiska instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD), mikro-, dissekera pincett, böjd spets (t.ex. Roboz # RS5137).
2. Fjädring medium: Medium 199 innehållande 0,1% bovint serumalbumin, 100 enheter / ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 2,5 mikrogram / ml amfotericin B. Reagenser finns från Invitrogen, Karlsbad, Kalifornien.

Förfarande:

1. Euthanize nyfödda råttor (i åldern 2-4 dagar) i enlighet med riktlinjer från National Institutes of Health, Bethesda, MD.
2. Ta bort ögonlocken med kirurgisk sax. Tryck försiktigt med böjd pincett på motsatta sidor av ögonhålan för att tvinga ögat buktar utåt. Gör ett litet snitt på bakre sidan av ögat med saxen. Genom att trycka med pincett mot sidan av ögat mittemot snitt, kan linsen och en liten mängd bifogade glaskropp då tvingas ut genom brott, vilket gör att objektivet kan plockas upp med böjda pincett. Försiktighet bör iakttas inte bryta objektivet kapsel.
3. Använd den böjda pincett för att överföra linser till en 60mm plast vävnadsodling maträtt som innehåller 5ml varm, steril suspension medium.

Del 2: Microdissection av explants

Material och reagens:

1. Micro Analysera Pincett, 0,1 mm tips (som Roboz RS-4976). Vi använder Dumostar legering på grund av flexibiliteten i spetsen, men andra stållegeringar godtas också. Pincett med tips tunnare än 0,1 mm rekommenderas inte, eftersom de tenderar att bryta eller böja under denna procedur.
2. Fjädring medium (se del 1)
3. Unsupplemented Hams F12 medium eller Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)

Förfarande:

1. Följande steg bör utföras i en ren, dragfri miljö med steril dissekera verktyg och sterilt medium.
2. Med hjälp av en stereo-dissekera mikroskop, linserna av allt fastsittande vävnader med 0,1 pincett mm spets och överföra dem till en andra 60mm kultur maträtt som innehåller 5 ml steril suspension medium (detta steg bidrar till att minska föroreningar). Med pincett, överföra önskat antal objektiv till ett 35mm kultur maträtt som innehåller 5ml sterilt, unsupplemented medium. (Vi använder ofta Hams F12 (Invitrogen) för detta steg, eftersom den lägre färgämnet koncentrationen gör dissektion lättare, men det är Medium 199 också godtagbar Inga antibiotika eller andra tillägg behövs under detta steg..) Så många som 12 explants kan göras i mitten av en maträtt denna storlek. Bör dock en 35 mm maträtt användas även om färre explants ska göras, eftersom dissekera verktyg inte kan manipuleras enkelt i en mindre skål. Överför skålen innehåller de kvarvarande linser för att en vävnadsodling inkubator vid 37 ° C tills de behövs.
3. Identifiera den bakre sidan av linsen. Det finns många sätt att erkänna detta: 1) Den bakre är rundare än den främre, som är något tillplattad, 2) nyfödd råtta linser formen kallt grå starr som de svalna till rumstemperatur under dissekering. Om kylan katarakt har inte helt fylld linsen, är den bakre sidan sidan längst bort från ogenomskinlig regionen. Om opacitet har fyllt linsen, uppvärmningen skålen till 37 ° C i några minuter kommer att vända det. Den bakre sidan kan identifieras som den grå starr reformerna på kylning. 3) Spår i Tunica vasculosa lentis kan vara synliga på den bakre sidan. 4) Den bakre sutur kan vara synliga på den bakre sidan. Identifiera den bakre sidan på rätt sätt är viktigt, eftersom det är där kapseln öppnas. Öppning linsen på den främre sidan kommer att riva epitelet.
4. När den bakre sidan har identifierats, vrid den uppåt och ta tag i linsen i vänster pincett (för en högerhänt arbetstagare). Då klämmer den bakre kapseln med rätt pincett för att producera en liten vik.
5. Håll bakre kapsel med rätt pincett, ta tag i veck i kapseln med vänster pincett och dra ut två par pincett i motsatt riktning för att göra en liten tår i kapseln.
6. Medan greppa kanten av återgång kapsel med pincett, dra den nedåt, först på ena sidan och sedan på den andra, att trycka in den i plast av skålen med pincett. Upprepa detta flera gånger, flytta runt ekvatorn av linsen, tills kapseln är ordentligt fäst vid plattan på många punkter. Håll kapseln på plats med vänster pincett, skaka fiber massa med rätt pincett för att bryta den bifogade filen mellan fiber-celler och epitelceller på linsen ekvatorn. Tryck sedan fibern massan bort, rulla bort den från kapseln / epitel, som sitter kvar på botten avmaträtt. Fortsätt denna process med alla objektiv i skålen. Ta bort och kasta den fiber massorna (eller spara dem frysta som en källa till objektiv proteiner för övriga studier).

Del 3: Microdissection och kultur i centrala explants

Material och reagens:

1. Sterila engångs skalpell, # 15 blad, (Cincinnati kirurgiska Co Cincinnati, OH)
2. Steril fosfatbuffrad koksaltlösning med kalcium och magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Odlingsmedium: Avstängning medium som innehåller 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO).

Förfarande:

1. Med en steril skalpell, klippa bort den perifera epitelet (PE), som innehåller celler i ett tidigt skede av differentiering (Figur 1A), vilket ger ett centralt torg ca 2,0 mm på en sida, bestående av centrala epitelceller bara (CE) (Figur 1B).
2. Överför skålen som innehåller det centrala explants till en biosäkerhet skåp. Tvätta tre gånger med sterilt PBS som innehåller kalcium och magnesium och en gång med 1 ml färsk, jämvikt (37 ° C, 5% CO ₂₎ fjädring medium. Dessa tvättar kraftigt minska risken för smittspridning.
3. Tillsätt 2 ml odlingsmedium att inducera differentiering ¹ och placera explants i en fuktig, vävnadskultur inkubator vid 37 ° C, 5% CO _2. Kultur perioder kan vara så kort som några timmar eller förlänga så länge som två till tre veckor, beroende på de parametrar som skall studeras. Medel bör bytas varannan eller var tredje dag.

Del 4: Skörd av explants för analys av händelser i samband med differentiering

1. Skörd explants för analys av protein eller RNA

Material:

1. Microdissecting pincett
2. SDS lyseringsbuffert eller RNA-senare

Förfarande:

1. I slutet av inkubationstiden, ta bort odlingsmedium.
2. Med hjälp av stereo-dissekera mikroskop, försiktigt lossa kanterna på varje Explantation.
3. Lyft varje Explantation med pincett och överföra den till ett rör innehållande ca 100μl SDS lyseringsbuffert (för protein analys) eller RNA-senare (för RNA-analys). Rör spetsen av pincett i lösningen för att säkerställa att Explantation inte fastnar på pincett.

2. Skörd explants för immunofluorescens

Material och reagens:

1. Fosfatbuffrad saltlösning med kalcium och magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. Fosfatbuffrad saltlösning (utan kalcium och magnesium) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. 4% paraformaldehyd (Boston Bioproducts, Worcester, MA)
4. Microdissecting pincett
5. Hydrophobic märkpenna
6. Glas objektglas
7. 0,25% Triton X-100 i fosfatbuffrad saltlösning.

Förfarande:

1. Skölj explants kortfattat i PBS som innehåller kalcium och magnesium.
2. Fix vävnader genom att lägga till 4% paraformaldehyd i 30 minuter i rumstemperatur.
3. Ta bort fixativ och ersätt med fosfatbuffrad saltlösning. Fast explants blivit något stela, vilket gör att lyftas och överföras till glasskivor för immunfärgning.
4. Placera en liten droppe PBS (utan kalcium och magnesium) i bilden för att placera vävnad och förhindrar curling. Använda microdissecting pincett, lyfta Explantation och för in den i drop på bilden. Utan att vidröra Explantation, försiktigt bort vätskan med ett papper veken till platta till explantation på glaset och låt vävnaden torka i luft vid rumstemperatur i 3 till 5 minuter.

Figur 1 A. perifera epitel uttrycker differentiering-specifika proteiner. Den Explantation visades kunde immunostained för N-cadherin omedelbart efter microdissection. Expression ses i ett band av celler i det perifera epitel, vilket tyder på att celler i denna region har börjat differentiera. B. perifera epitel kan klippas bort för att avlägsna celler som uttrycker N-cadherin och andra differentiering-specifika proteiner. Den röda annulus representerar placeringen av celler som uttrycker N-cadherin, medan det lilla torget som beskrivs i grått representerar kvadranten av epitel som visas i panelen 1A. De perifera epitel kan tas bort genom fyra skalpell skär och lämnar ett centralt torg som bara innehåller celler som ännu inte har börjat differentiera.

Discussion

Råttan Objektivet Explantation Systemet har framgångsrikt använts av ett antal laboratorier för att studera terminal differentiering av lins epitelceller att linsen fibrer ^21,3,4,5. När de utsätts för FGF-2 på 100ng/ml i explants kommer att börja visa förändringar i signalering inom några minuter ^6, med förändringar i morfologi och genuttryck visas sekventiellt under flera dagar ^3,4,5. De kulturer förblir livskraftiga i 2-3 veckor om försiktighet vidtas för att förhindra kontaminering.

Den centrala explants som beskrivs i detta protokoll är särskilt användbara för att studera händelseförloppet i samband med differentiering, eftersom de innehåller få om ens några celler som uttrycker differentiering markörer innan FGF-2 läggs ^1,5. Cellerna skilja sedan synkront, som en kohort, vilket gör det möjligt att följa tidsförloppet för signalering och transkriptionell händelser i samband med differentiering. Odling explants för olika lång tid ger således korrekt tidsmässig information om sekvensen händelser. Specifika hämmare kan läggas till odlingsmediet att identifiera relevanta signalvägar. Explants kan användas för att analysera proteinuttryck av SDS gelelektrofores och immunoblotting eller analysera uttrycket av specifika mRNA genom RT-PCR. Protein ger intervallet 20 till 50 mikrogram / Explantation och RNA avkastning är cirka 200 - 600 ng / Explantation, beroende på längden av kulturen period. Vi finner i allmänhet att 5-6 explants per fat kommer att ge tillräckligt med protein eller RNA för flera analyser. RNA från explants kan också användas för att förbereda cDNA för bedömning av genuttryck med microarray analys, som kan identifiera nya gener som kan vara avgörande för differentiering. Explants kan också transfekterades. Även transfektion effektivitet är generellt låga, är det tillräckligt för testmetoder reporter gener ^{4, 7, 8.} Immunofluorescensmikroskopi av explants ger ett bra komplement till biokemiska metoder genom att bestämma subcellulära lokalisering av proteiner av intresse. Således ger förberedelse och kultur explants råtta objektivet ett kraftfullt system för att studera differentiering terminal lins hos däggdjur, vilket kan komplettera in vivo tekniker, såsom generering av transgena och knock-out möss.