Summary
Este vídeo describe el método utilizado para el aislamiento de neuroprecursors de la corteza en desarrollo de embriones de ratones. El procedimiento para la eliminación de embriones del útero, la disección de los tejidos corticales, y la digestión de la corteza cerebral aislada se muestra.
Abstract
Cultivos primarios de células madre neurales son útiles para el estudio de los mecanismos que subyacen al desarrollo del sistema nervioso central. Investigación con células madre aumenta nuestra comprensión del sistema nervioso y puede ayudarnos a desarrollar tratamientos para enfermedades actualmente incurables del cerebro y lesiones. Además, las células madre deben ser utilizadas para la investigación de células madre como objetivo el estudio detallado de los mecanismos de diferenciación neuronal y la transdiferenciación y las señales genéticas y ambientales que dirigen a la especialización de las células en un tipo celular particular. Este vídeo muestra una técnica utilizada para desagregar las células a partir del día embrionario 12.5 cerebro anterior dorsal del ratón. El procedimiento incluye la disección de la cosecha E12.5 embriones de ratón desde el útero, la eliminación de la "piel" con finas pinzas de disección y, finalmente, aislar trozos de la corteza cerebral. Después de la disección, el tejido se digiere y se disocian mecánicamente. Las células disociadas se resuspendieron luego se cultivaron en "células madre", los medios de comunicación que favorece el crecimiento de las células madre neurales.
Protocol
- Precursores neuronales de ratón (CPN) se aislaron de la corteza de embriones E12.5.
- Capas de la piel y mesenquimales fueron retirados de las vesículas telencefálicas disecados.
- Vesículas fueron incubadas en el 0,05% de tripsina al 0,02% de EDTA y 0,2% de BSA en HBSS durante 20 minutos a 37 ° C.
- Tripsinización fue detenido por un volumen igual de 1 mg / ml de inhibidor de tripsina de soja (Sigma # T6522) en HBSS.
- Digiere los tejidos se disocian con varias rondas de trituración con pulido al fuego pipetas Pasteur.
- Las células se lavaron una vez con el 0,2% de BSA en HBSS y chapada a 50.000 células / ml en laminina recubierto cubreobjetos en los medios de comunicación con 20 ng / EGF ml, 10 ng / ml FGF2 (R & D Systems o Peprotech), y 2 ug / ml de heparina ( Sigma).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grandes avances en nuestra comprensión del desarrollo del SNC y la biología de células madre han sido posible gracias a nuestra capacidad de cosecha, aislar y cultivar células madre embrionarias neural. Este video muestra la disección de la corteza cerebral del ratón E12.5 y la desagregación posterior y el cultivo de células embrionarias madre neurales. Muchos otros métodos similares han sido utilizados con éxito por otros investigadores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight Iris Scissors | Tool | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Medium Scissors | Tool | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Micro Scissors | Tool | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Bent Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-35 |
References
- Currle, D., Cheng, X., Hsu, C., Monuki, E. Direct and indirect roles of CNS dorsal midline cells in choroid plexus epithelial formation. Development. 132 (15), 3549-3559 (2005).
- Flanagan, L., Rebaza, L., Derzic, S., Schwartz, P., Monuki, E. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J Neurosci Res. 83, 845-856 (2006).
