Summary
Deze video beschrijft de methode die wordt gebruikt voor het isoleren van neuroprecursors uit de ontwikkelingslanden cortex van embryonale muizen. De procedure voor het verwijderen van embryo's uit de baarmoeder, het ontleden van de corticale weefsel, en verteren de geïsoleerde cerebrale cortex wordt weergegeven.
Abstract
Primaire neurale stamcellen culturen zijn nuttig voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het centrale zenuwstelsel ontwikkeling. Stamcelonderzoek zal ons begrip van het zenuwstelsel en kan ons in staat stellen om behandelingen voor momenteel ongeneeslijke hersenziekte ziekten en verwondingen te ontwikkelen. Daarnaast moet stamcellen worden gebruikt voor stamcelonderzoek gericht op de gedetailleerde studie van de mechanismen van neurale differentiatie en transdifferentiatie en de genetische en omgevingsfactoren signalen die direct de specialisatie van de cellen in bepaalde celtypes. Deze video demonstreert een techniek die gebruikt wordt om cellen van de embryonale dag 12,5 muis dorsale voorhersenen splitsen. De dissectie procedure omvat het oogsten E12.5 muis embryo's uit de baarmoeder, het verwijderen van de "skin" met fijne ontleden tang en uiteindelijk het isoleren van stukjes van de cerebrale cortex. Na de dissectie, is het weefsel verteerd en mechanisch gescheiden. De geresuspendeerde gescheiden cellen worden vervolgens gekweekt in "stamcel" media dat de groei van neurale stamcellen gunsten.
Protocol
- Muis neurale precursoren (NPC's) werden geïsoleerd uit embryo E12.5 cortex.
- Huid-en mesenchymale lagen werden verwijderd uit ontleed telencephalic blaasjes.
- Blaasjes werden geïncubeerd in 0,05% trypsine met 0,02% EDTA en 0,2% BSA in HBSS gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
- Trypsinisatie werd gestopt door een gelijk volume van 1 mg / ml soja trypsine-remmer (Sigma # T6522) in HBSS.
- Tissue digesten werden losgemaakt met behulp van verschillende rondes van tritureren met vuur gepolijst pasteurpipetten.
- Cellen werden eenmaal gewassen met 0,2% BSA in HBSS en uitgeplaat op 50.000 cellen / ml op laminine-gecoate dekglaasjes in de media met 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml FGF2 (R & D Systems of Peprotech), en 2 ug / ml heparine ( Sigma).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grote vooruitgang in ons begrip van CNS ontwikkeling en stamcelbiologie zijn mogelijk gemaakt door ons vermogen om te oogsten, te isoleren en cultuur embryonale neurale stamcellen. Deze video toont de ontleding van E12.5 muis hersenschors en de daaropvolgende disaggregatie en het kweken van embryonale neurale stamcellen. Veel andere andere, soortgelijke middelen zijn succesvol toegepast door andere onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight Iris Scissors | Tool | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Medium Scissors | Tool | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Micro Scissors | Tool | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Bent Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-35 |
References
- Currle, D., Cheng, X., Hsu, C., Monuki, E. Direct and indirect roles of CNS dorsal midline cells in choroid plexus epithelial formation. Development. 132 (15), 3549-3559 (2005).
- Flanagan, L., Rebaza, L., Derzic, S., Schwartz, P., Monuki, E. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J Neurosci Res. 83, 845-856 (2006).
