Summary
نحن تصف إجراءات تفصيلية لترنسفكأيشن فعالة من الحمض النووي البلازميد في ألياف عضلات القدم من الفئران الحية باستخدام electroporation والتصور لاحقة من بروتين تعبير باستخدام المجهر مضان.
Abstract
والاهتمام المتزايد في بيولوجيا الخلية وأشكال التعبير عن تعديل transgenically من البروتينات الضرورية (على سبيل المثال يبني الموسومة fluorescently و / أو المتغيرات متحولة) من أجل التحقيق في توزيعها وأهميتها الذاتية الوظيفية. مقاربة مثيرة للاهتمام التي تم تنفيذها لتحقيق هذا الهدف في خلايا متمايزة تماما هو
Protocol
إجراءات تجريبية في عضلات الجسم الحي electroporation FDB وIO
- قبل البدء في بروتوكولات electroporation الجسم الحي ، لا بد من تضخيم البلازميدات التعبير الثدييات لانتاج التركيز في نطاق ل2-5 ميكروغرام ملاحظة البلازميد / ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات : نحن نستخدم عادة مجموعات التضخيم التجارية ومتابعة إجراءات الشركة المصنعة. البلازميدات التعبير تجارية تحمل المروج CMV عمل بشكل جيد جدا في العضلات والهيكل العظمي في الجسم الحي transfections.
- قسامة حجم الضرورية (10-20 ميكرولتر) من الحل البلازميد وحفظه في اثنين من 0.5 مل أنابيب إيبندورف (واحد لكل سفح الماوس).
- تحضير محلول يحتوي على 2 ملغ / مل هيالورونيداز في Tyrode العقيمة.
- باستخدام التخدير مربع ، تخدير عميق ماوس باستخدام 4 ٪ في isoflurane O2 مع جهاز غاز مخدر المعتمدة. وضع الحيوانات على لوحة التدفئة (37 درجة مئوية) ، والحفاظ على التخدير باستخدام قناع الوجه القوارض. رصد عمق التخدير بواسطة منعكس قرصة أخمص قدميه.
- تحت الملاحظة مع مجهر تشريح ، وضخ 10 ميكرولتر من الحل هيالورونيداز تحت قطاع الطرق من قدم واحدة من الفأرة باستخدام 1 "طويلة إبرة قياس 33 العقيمة. تخترق الجلد عند نقطة قريبة من كعب القدم ودفع إبرة تحت الجلد في اتجاه قاعدة للأصابع ~ 1 / 4 ".
- كرر الإجراء مع القدم الأخرى ، إذا رغب في ذلك.
- افصل التخدير ومكان الماوس في قفص. تسمح له حتى يتعافى تماما من التخدير.
- بعد ساعة واحدة ، تخدير الحيوان للمرة الثانية ووضعه على لوحة التدفئة. باتباع نفس الإجراء الموصوفة من أجل حل هيالورونيداز ، وضخ ما مجموعه 20-50 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (اعتمادا على حجم بناء البلازميد). إجمالي حجم الحقن يجب أن تكون أقل من 20 ميكرولتر / قدم ملاحظة : عندما 15-20 L μ ضروري ، فإنه من المستحسن لإغلاق الجلد في إبرة نقطة الدخول مع الغراء الأنسجة.
- افصل التخدير ومكان الماوس في قفص. تسمح لها أن يتعافى تماما من التخدير وانتظر لمدة 10-15 دقيقة.
- تخدير الحيوان للمرة الثالثة ووضعه على لوحة التدفئة.
- حدد قدم واحدة من الحيوان. مكان واحد إبرة الوخز بالإبر مطلية بالذهب تحت الجلد في كعب ، وثانية واحدة على قاعدة من أصابع القدم. الأقطاب الكهربائية هي موازية موجهة إلى بعضهم البعض وعمودي على محور طويل من القدم.
- ربط رئيس الإبر (الأقطاب الكهربائية) إلى منشط الكهربائية باستخدام قصاصة صغيرة الموصلات. Electroporate عضلات من خلال تطبيق 20 البقول ، و 20 مللي ثانية في المدة / لكل منهما ، في 1Hz. اعتمادا على المباعدة بين الأقطاب ، يتم ضبط السعة والبقول "الجهد (عن طريق رصد مع الذبذبات) لانتاج حقل كهربائي من ملاحظة V ~ 100 / الطول : لا تقلصات في الاستجابة للمنبهات وينبغي أن يكون لاحظ إذا كان مستوى تخدير كافية.
- إذا رغبت في ذلك ، كرر الإجراءات المذكورة أعلاه في المقابل قدم الحيوان.
- عودة إلى قفص الحيوان وتعافى بشكل كامل مرة واحدة من التخدير الحفاظ عليه تحت الملاحظة. ملاحظة : إذا كان الإجراء ذهب عادة ، هذا الحيوان يجب أن تستعيد الحركة بالكامل في غضون 30 دقيقة ويتم بعد ذلك جاهزة لإرسالها إلى غرفة الحيوان في الحظيرة. وحقن هيالورونيداز والحمض النووي في قطاع الطرق ليس لديها آثار سلبية ملحوظة على الحيوانات. تعافى مرة واحدة من التخدير ، والفئران قادرة على التمهل عادة حول القفص. كإجراء وقائي إضافي ، إضافة إلى مياه الشرب للحيوان في كاربروفين 0.0027 ملغم / لتر لمدة 2 أيام باعتباره مسكن.
- يمكن أن يعاير بروتين تعبير 2-8 أيام بعد ترنسفكأيشن. ومع ذلك ، فقد لوحظ التعبير المتواصل من العديد من البروتينات لمدة شهور.
ملاحظة : تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المستشار في جامعة كاليفورنيا لجنة البحوث الحيوانية التي كلفتها بها قانون رعاية الحيوان وPHS السياسات بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية.
ممثل النتائج :
وينبغي أن التنفيذ الصحيح للإجراءات المذكورة أعلاه electroporation المجراة في ترنسفكأيشن نتيجة فعالة من البلازميدات في العضلات وFDB IO. ومع ذلك ، فإن فعالية للتعبير عن المتغيرات البروتينات المعدلة وراثيا سيعتمد على البلازميد ، وحجم وتعقيد من البروتين ، والخصائص الفنية للبروتين ، وعدد من المتغيرات الأخرى خارج سيطرتنا. كما هو موضح في الشكل رقم 1 لعضلة FDB electroporated في وجود الترميز (PMR - mCherry) البلازميد التجارية للبروتين mCherry ، يتم transfected معظم الألياف العضلية مع بروتوكول لدينا كما يتضح من حقيقة أن معظمهم من عرض مضان أحمر. هذا لا يستبعد احتمال أن الألياف الفردية تتميز بدرجات مختلفة من بروتين تعبير ، أو التي لا transfected ألياف قليلة في جميع 3. يجب أن بلاحظ أن التعبير ه كفاءة كميات كبيرة من البروتينات الفلورية مثل mCherry ، EGFP ، ECFP وEYFP ، لا يخل استثارة للألياف العضلات 'وخصائص اقتران الإثارة - الانكماش. في الواقع ، فهي لا تختلف عن تلك الموجودة في العضلات صورية transfected (النتائج غير معروضة).
النهج العملي للتحقق من استخدام تعبير المترجمة من البروتينات fluorescently الموسومة في ألياف العضلات والهيكل العظمي.
يتم تقييمها بشكل روتيني التعريب من البروتينات داخل الخلايا دي نوفو المعدلة وراثيا التي أعرب عنها في وقت واحد الحصول على ، وذلك باستخدام TPLSM والصور الفلورسنت من علامات كل منها علامات وصور محددة جيدا من الهياكل الخلوية. الأكثر نموذجية لهذه الأخيرة هي : أ) الثاني التوافقي جيل (SHG) الصور ، والتي تنشأ من تباين الميوسين من sarcomeric A نطاقات (تركز على خطوط M -) 9،10 ، وب) دي - 8 - ANEPPS مضان الصور ، التي يمكن الحصول عليها عن طريق وضع العلامات على السطح والعرضي أنبوبي (T - نبيب) نظام الأغشية من ألياف العضلات مع dye11 هذا potentiometric impermeant. في الصور مضان من الألياف العضلية ملطخة دى ANEPPS - 8 ، تي نبيبات تظهر نطاقات ضيقة من مضان متعامد تقريبا موجهة إلى المحور طويلة من الألياف. متباعدة بشكل غير متكافئ من هذه العصابات بعضها البعض : ويفصل بينهما مسافة طويلة التي تمتد عبر خطوط M - واحد القصيرة التي تمتد عبر 11 خط Z -.
التعبير وتوطين α - actinin - EGFP في ألياف العضلات والهيكل العظمي.
مثال للتعبير عن متغير المفتاحية للبروتين العضلات الهيكلية هو مبين α - actinin في الشكل 2. ويعرف هذا البروتين ليكون عنصرا رئيسيا في خط Z - ، وعلى هذا النحو ، ويستخدم بشكل روتيني باعتباره علامة على هذا structure12. ونحن transfected FDB IO العضلات مع ترميز pEGFPN1 - α - actinin1 البلازميد للتنمية البشرية (العضلات غير) α - actinin المفتاحية في محطة C مع EGFP. بعد ستة أيام من ترنسفكأيشن ، وجدنا أنه ، وفقا لتقييم توزيع مضان EGFP ، يعبر معظمها α - actinin في نطاقات ضيقة متباعدة بالتساوي على طول المحور الألياف. وينظر الى فرقة واحدة لكل قسيم عضلي (أرقام 2A و 2D). وأظهرت colocalization من هذه العصابات مع Z - خطوط بمقارنة توزيع مضان EGFP مع SHG (الشكل 2B) ودي - 8 - ANEPPS (2E الشكل) الصور. كما يتضح من صورة التراكب (الشكل 2C) ، α - actinin - EGFP العصابات تتناوب مع الفرق SHG ، مشيرا إلى أن وجدوا في منتصف المسافة بين شريطين M - متتالية ، بالتزامن مع موقع Z - الأسطر. في ألياف العضلات transfected ملطخة دى ANEPPS - 8 ، وينظر α - actinin - EGFP العصابات في الوسط بين كل زوج من T - نبيبات (الشكل 2F) والتي هي معروفة في تطويق وخطوط Z (أي فصل من أقصر مسافة) ، مما يدل على أن يتم استهداف المعدلة وراثيا α - actinin إلى Z - السطر.
التعبير عن DHPRα1s المفتاحية في النهاية - N مع EGFP
يتم التحقق من كفاءة العضلات مع ترنسفكأيشن pEGFPC1.1 - 1S DHPR α TPLSM في الصور (مثل الشكل 3A) تبين أن معظم الألياف أعرب EGFP - DHPRα1s (بروتين عبر الغشاء). الميزة الأبرز للألياف transfected هو نمط مزدوج النطاقات من مضان EGFP (أرقام 3A و 3B) كما هو متوقع إذا تم استهداف هذا البروتين إلى نبيبات - T. ويمكن أيضا أن يكون لوحظ في الشكل (3) في حين أن ألياف مختلفة عرض مستويات مختلفة من كثافة مضان ، ونمط النطاقات مضان من الألياف الفردية ويبدو أن الحفاظ على متجانسة على طول الألياف. في أعلى التكبير (الشكل 3B) ، فإنه يمكن رؤيتها بوضوح أن التباعد بين نطاقات متفاوتة هي مماثلة لتلك التي لوحظت في ألياف ملطخة دي - 8 - ANEPPS (مثل الشكل 2E). تراكب الصور (الشكل 3B 3E و) تبين أن تقع ضمن نطاقات SHG أكبر التباعد بين EGFP - DHPRα1s العصابات ، مؤيدة أن هذا البروتين هو في T - الأنابيب. قياسات إضافية الحنق مع أنيون غير محبة للدهون DPA - فلوري (لا تظهر البيانات) تبين كذلك أن شاردة EGFP نانومتر ضمن عدد قليل من النشرة الداخلية للأغشية تي الأنابيب.
التعريب والتقييم الفنية للتعبير عن EYFP - ClC1
ألياف transfected مع pEYFP - ClC1 ، الذي يشفر an بناء EYFP الموسومة (في محطة N -) من قناة العضلات كلوريد الهيكل العظمي (ClC1) ، وعرض أشرطة EYFP مضان (الشكل 4A) مع وجود نمط مماثل لذلك الذي لوحظ لEGFP - DHPRα1s "التعبير (الشكل 3A) وما يقابلها على الترتيب T - نبيب كما هو موضح مع تلوين دي - 8 - ANEPPS (2E الشكل). كما هو متوقع ، من استعلاء EYFP - ClC1 الشكل (4A) والصور SHG (الشكل 4B) كما هو موضح في تراكب (الشكل 4C) ، تبين أن تتركز الفرق SHG في تباعد كبير سو بين العصابات EYFP مضان.
من أجل تقييم ما إذا كان التعبير عن EYFP - ClC1 النتائج في زيادة كبيرة في تصرف يستريح من ألياف العضلات ، كما هو متوقع من overexpression من كلوريد القنوات الفنية ، ونحن الألياف العضلية نأت إنزيمي من عضلة FDB transfected ودرست خواصها الكهربية باستخدام microelectrodes اثنين وصف الإعداد التجريبية سابقا 6،11،13. ويبين الشكل 5 نتائج اثنين من الألياف : واحد التعبير عن كميات كبيرة من EYFP - ClC1 والمقررة من القياسات العالمية في كثافة مضان المجهر مضان القياسية (لا يظهر) ، والآخر هو السيطرة غير transfected. السجل الجهد في الشكل 5A (تم الحصول عليها من ألياف العضلات ، معربا عن EYFP ClC1) يدل على أنه نظرا لتصرف على الراحة المفرطة ، ويكاد يكون من الألياف غير منفعل. حاجة البقول التحفيز الحالية 400nA تصل إلى (0.5ms) ليتم استخدامها من أجل الحصول على استجابة نشطة صغيرة جدا (لا 5A التجاوز الشكل ،). بعد استبدال الحل Tyrode الخارجية إلى واحد تحتوي على 500 ميكرومتر من كلوريد مانع قناة 9 ACA ، والبقول 200 NA الحالية كافية للحصول على إمكانية العمل (الشكل 5B) ، ولو بوتيرة ابطأ بكثير وأوسع من تلك التي سجلت في الألياف التحكم ( الشكل 5C). وبالإضافة إلى ذلك من ACA - 9 كما هو متوقع ، الحد الأدنى من الآثار على هذه الألياف التحكم (الشكل 5D).
الشكل 1. ترنسفكأيشن كفاءة من الأسلوب electroporation داخل الجسم الحي. Brightfield (A) ومضان (B) لوحات من العضلات مع mCherry transfected FDB - PMR. بعد أيام من بروتوكول electroporation : 12 يوما. الرجاء النقر هنا لنسخة أكبر من الرقم 1.
الشكل 2. التعبير واستهداف α - actinin - EGFP في الألياف FDB. وحات A و B EGFP مضان SHG والصور ، على التوالي ، معربا عن وجود الألياف α - actinin - EGFP. لوحة C هو تراكب الصور في مد ألف وباء وهاء لوحات وصورا أخرى من الألياف مضان معربا عن α - actinin - EGFP وملطخة دى ANEPPS - 8 ، على التوالي. لوحة F هو تراكب الصور في مد وبعد أيام E. بروتوكول electroporation : 6 أيام.
الشكل 3. التعبير واستهداف EGFP - DHPRα1s FDB في الألياف. لوحة A ، EGFP صورة مضان من مجموعة من الألياف ، معربا عن EGFP DHPRα1s. الفريق B هو توسيع مربع في لوحة ولكي تظهر على نحو أفضل نمط من التعبير النطاقات البروتين. لوحة C هي صورة SHG المقابلة للصورة في لوحة لوحة D ألف هو تراكب من الصور ألف وجيم لوحة E هو توسيع المنطقة المشار إليها في يوم دال وحة بعد بروتوكول electroporation : 20 يوما.
الشكل 4. التعبير واستهداف EYFP - ClC1 FDB في الألياف. لوحات A و B EYFP مضان SHG والصور ، على التوالي ، من ألياف معربا عن EYFP - ClC1. لوحة C هو تراكب الصور في لوحات ألف وباء D الفريق هو التعريف كثافة يقاس على طول الخط الأبيض سلط عليها الضوء في الصورة في لوحة بعد يوم جيم بروتوكول electroporation : 7 أيام.
الشكل 5. الألياف الكهربية معربا عن تقدير وراثيا EYFP - ClC1. وحات A و B السجلات الجهد من الألياف ، معربا عن EYFP ClC1 ردا على البقول الحالي قبل وبعد العلاج مع ACA - 9 ، على التوالي. لوحات جيم ودال من السجلات الجهد (العمل إمكانات) استدعت ردا على البقول الحالي في الألياف غير transfected قبل وبعد العلاج مع ACA - 9 ، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف الخطوات التفصيلية التي يجب اتباعها من أجل تحقيق فعالية transfections البلازميدات الحمض النووي في ألياف العضلات والهيكل العظمي التي electroporation في الجسم الحي. المزايا الرئيسية لنهجنا هي البساطة في التنفيذ ، والغزو ويعتبر الحد الأدنى الذي ينتج مخاطر صحية ضئيلة للحيوانات. في الواقع ، وفوق بروتوكولات electroporation صفها لا تنطوي على أكثر بكثير من الحقن تحت الجلد اثنين في القدم ، وتليها بروتوكول التحفيز الكهربائي ، وكلها جيد التحمل من الحيوانات تحت التخدير. في مؤسستنا مصممون تماما أن هذه المعالجات غير الجراحية لأنها لا تشمل فتح الجلد. الى جانب ذلك ، وخفة من الإجراءات electroporation يشكل عاملا حاسما لتحقيق النجاح العام في تحقيق وقف ترنسفكأيشن كفاءة البلازميد والتعبير عن بروتين لاحق من ألياف العضلات لأن أي تلف الخلايا الكبيرة وتضعف قدرتها على المشاركة بفاعلية في عملية تخليق البروتين النشط.
يمكن إجراء تعديلات طفيفة على الإجراءات المذكورة هنا أن (ولقد) تنفيذا لأكبر عضلات القدم الماوس (على سبيل المثال الطويلة الباسطة لأصابع ، مؤسسة كهرباء لبنان ؛ الظنبوبي الأمامي ، TA ؛ والعضلات النعلية). علاوة على ذلك ، عن طريق التوسع حتى مجرد المبلغ الإجمالي من الحمض النووي ، وقمنا بتنفيذ الإجراءات الدقيقة الموصوفة هنا من أجل transfect عضلات FDB وIO الجرذان الكبار مع نجاحا كبيرا.
على الرغم من البروتوكولات ترنسفكأيشن النتيجة دائما في مستوى التعبير عن متغير من البروتينات المعدلة وراثيا عن طريق ألياف العضلات ، يمكن أن تؤخذ من هذه الميزة في التجارب الفسيولوجية ، ويمكن استخدام ألياف غير التعبير عن والضوابط ، ويمكن استخدام الألياف مع مستويات مختلفة من التعبير لربط مستوى التعبير مع تغير مستوى الوظيفة. أيضا ، تم العثور على المروجين CMV لتكون مناسبة في انتاج مستويات عالية من بروتين تعبير ، وغيرها من العضلات محددة المروجين قد تحسن فعالية بروتين تعبير. وتجدر الإشارة إلى أنه عندما لا يكون ممكنا (أو مريحة) للتعبير عن بروتين يبني fluorescently الموسومة في ألياف العضلات ، ونجحنا في التعبير عن البروتينات معلم ورصد مستوى التعبير البلازميدات مع bicistronic التي تكود في وقت واحد بروتين فلوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر الدكتور T. أوتيس ، قسم علم الأعصاب ، جامعة كاليفورنيا ، لتقاسم مرفق TPLSM معنا ، الدكتور جيم Fahlke ، معهد الفيزيولوجيا ، آخن ، ألمانيا ، على سبيل الهبة الكريمة من البلازميد pEYFP - ClC1 ، والسيد . ر سيرانو للدعم التقني. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة / NIAMS المنح وAR047664 AR54816.
References
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).
- DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system. Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).
- Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons. Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle. Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).
- DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).
- Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy. J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres. Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).
- DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS. J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).
- Mills, M. Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).
