Summary
We beschrijven gedetailleerde procedures voor de efficiënte transfectie van plasmide DNA in de vezels van mond spieren van levende muizen met behulp van elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van eiwitexpressie met behulp van fluorescentie microscopie.
Abstract
Een groeiende interesse in de celbiologie is transgenically gemodificeerde vormen van essentiële eiwitten (bv. fluorescent gelabelde bouwt en / of gemuteerde varianten) te drukken om hun endogene distributie en functionele relevantie te onderzoeken. Een interessante benadering die is ingevoerd om deze doelstelling te voldoen volledig gedifferentieerde cellen is de
Protocol
Experimentele procedures voor in vivo elektroporatie van de FDB en IO spieren
- Voordat u begint met de in vivo elektroporatie protocollen moeten zoogdieren expressieplasmiden worden versterkt de concentratie opbrengst in het bereik van tot 2-5 ug plasmide / ul van TE. NB: We routinematig gebruik van commerciële versterking kits en volg de fabrikant procedures. Commerciële expressieplasmiden het dragen van de CMV promoter werken heel goed in de skeletspieren in vivo transfecties.
- Aliquot het nodige volume (10-20 ul) van het plasmide oplossing en sla het op in twee 0,5 ml Eppendorf buizen (een voor elke voet van de muis).
- Bereid een oplossing die 2 mg / ml hyaluronidase in steriele Tyrode.
- Met behulp van een verlamming doos, diep verdoven een muis met behulp van 4% isofluraan in O2 met een goedgekeurde gas narcose machine. Leg het dier op een verwarmingselement (37 ° C) en onderhouden van de anesthesie met behulp van een knaagdier gezichtsmasker. Monitor de narcose diepte teen knijpen reflex.
- Onder observatie met een dissectie microscoop, injecteren 10 pi van de hyaluronidase oplossing onder de voetzolen van een voet van de muis met behulp van een een "lange 33 gauge steriele naald. Door de huid dringen op een punt dicht bij de hiel van de voet en subcutaan vooraf de naald naar de basis van de tenen voor ~ 1 / 4 ".
- Herhaal de procedure met de andere voet indien gewenst.
- Koppel de anesthesie en plaats de muis in een kooi. Laat het volledig herstellen van anesthesie.
- Na een uur, verdoven het dier voor de tweede keer en plaats deze op de verwarming pad. Volgens dezelfde procedure beschreven voor de oplossing hyaluronidase, injecteren een totaal van 20-50 ug van het plasmide DNA (afhankelijk van de grootte van het plasmide construct). Het totale injectievolume moet minder dan 20 pL / voet zijn. Opmerking: wanneer 15-20 μ L nodig is, is het raadzaam om de huid te sluiten bij de naald ingang met tissue-lijm.
- Koppel de anesthesie en plaats de muis in een kooi. Laat het volledig herstellen van de narcose en voor 10-15 minuten te wachten.
- Verdoven het dier voor de derde keer en plaats het op de verwarming pad.
- Selecteer een voet van het dier. Plaats een vergulde acupunctuur naald onder de huid aan de hiel, en een tweede aan de onderkant van de tenen. Elektroden zijn georiënteerd evenwijdig aan elkaar en loodrecht op de lange as van de voet.
- Sluit het hoofd van de naalden (elektroden) om de elektrische stimulator met behulp van micro-clip connectoren. Electroporate de spieren door het toepassen van 20 pulsen, 20 ms in duur / stuk, bij 1Hz. Afhankelijk van de afstand tussen de elektroden, is voltage amplitude van de pulsen 'aangepast (door de monitoring met een oscilloscoop) om een elektrisch veld van ~ 100 V / cm Let op opbrengst:. Geen contracties in reactie op de stimuli moeten worden geobserveerd indien het niveau van de verdoving voldoende is.
- Indien gewenst, herhaalt u de bovenstaande procedures in de contralaterale voet van het dier.
- Ga terug het dier zijn kooi en een keer volledig hersteld van de narcose te onderhouden onder observatie. Opmerking: als de procedure ging normaal, het dier moet volledige mobiliteit terug te krijgen binnen 30 minuten en daarna is klaar om terug te worden gestuurd naar het dier kamer in het terrarium. De injecties van hyaluronidase en DNA in de voetzolen hebben geen merkbare negatieve effecten op de dieren. Eenmaal hersteld van anesthesie, muizen zijn in staat om normaal te kuieren rond de kooi. Als extra voorzorgsmaatregel, toe te voegen aan het drinkwater van het dier Carprofen op 0,0027 mg / ml gedurende 2 dagen als een pijnstiller.
- Eiwitexpressie kan worden getest 2-8 dagen na transfectie. Echter, aanhoudende expressie van vele eiwitten waargenomen voor maanden.
OPMERKING: Alle dieren procedures werden goedgekeurd door Animal van de UCLA kanselier Research Committee als mandataris van de Animal Welfare Act en de PHS beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren.
Representatieve resultaten:
De correcte toepassing van de in vivo elektroporatie hierboven beschreven procedures moeten leiden tot daadwerkelijke transfectie van plasmiden in FDB en IO spieren. Echter, de efficiëntie van de expressie van transgeen eiwit varianten zal afhangen van het plasmide, de omvang en complexiteit van het eiwit, de functionele eigenschappen van het eiwit, en een aantal andere variabelen buiten onze controle. Zoals geïllustreerd in Figuur 1 voor een FDB-spier geëlektroporeerd in de aanwezigheid van een commerciële plasmide (PMR-mCherry) dat codeert voor mCherry eiwit, zijn de meeste van de spiervezels getransfecteerd met ons protocol zoals wordt geïllustreerd door het feit dat de meesten van hen weer te geven rode fluorescentie. Dit sluit niet uit dat individuele vezels verschillende graden van eiwitexpressie vertonen, of dat er weinig vezels niet getransfecteerd op alle 3. Het moet be merkte op dat de efficiënte expressie van grote hoeveelheden van fluorescerende eiwitten zoals mCherry, EGFP, ECFP, en EYFP, niet de spiervezels 'prikkelbaarheid en excitatie-contractie koppeling eigenschappen beïnvloeden. In feite zijn ze niet te onderscheiden van die in de sham getransfecteerde spieren (resultaten niet getoond).
Praktische benaderingen gebruikt om de gelokaliseerde expressie van fluorescent-gemerkte eiwitten in de skeletspieren vezels te controleren.
De intracellulaire lokalisatie van de di novo uitgedrukt transgene eiwitten wordt routinematig geëvalueerd door gelijktijdig het verwerven, het gebruik van de TPLSM, fluorescerende beelden van de respectievelijke labels en beelden van goed-geïdentificeerde markers van cellulaire structuren. De meest typische van deze laatste zijn: a) tweede harmonische generatie (SHG) beelden, die voortvloeien uit de myosine anisotropie van de sarcomeer A banden (gecentreerd op de M-lijnen) en 9,10, b), di-8-ANEPPS fluorescentie beelden, die kunnen worden verkregen door middel van etikettering het oppervlak en dwarse tubulaire (T-tubulus) systeem membranen van de spiervezels met deze impermeant potentiometrische dye11. In fluorescentie beelden van spiervezels gekleurd met di-8-ANEPPS, de T-tubuli verschijnen als smalle banden van de fluorescentie georiënteerd ongeveer loodrecht op de lange as van de vezel. Deze banden zijn ongelijk afstand van elkaar: ze zijn van elkaar gescheiden door een lange afstand die zich uitstrekt over de M-lijnen, en een korte een dat zich uitstrekt over de Z-lijn 11.
Expressie en lokalisatie van α-actinine-EGFP in de skeletspier vezels.
Een voorbeeld van de uitdrukking van een gelabeld variant van de structurele spiereiwit α-actinine is weergegeven in Figuur 2. Dit eiwit is bekend dat een belangrijke component van de Z-lijn zijn en als zodanig, routinematig wordt gebruikt als een marker van deze structure12. We FDB en IO spieren getransfecteerd met het plasmide pEGFPN1-α-actinin1 codering voor de mens (niet-spier) α-actinine gelabeld bij de C-terminal met EGFP. Zes dagen na transfectie, vonden we dat, zoals beoordeeld door EGFP fluorescentie distributie, α-actinine meestal wordt uitgedrukt in smalle banden gelijke afstand van elkaar langs de vezel-as. Een enkele band per sarcomeer wordt gezien (Figuren 2A en 2D). De colocalization van deze banden met de Z-lijnen wordt aangetoond door het vergelijken van de verdeling van EGFP fluorescentie met de SHG (Figuur 2B) en di-8-ANEPPS (figuur 2E) beelden. Zoals blijkt uit de overlay-afbeelding (figuur 2C), α-actinine-EGFP bands worden afgewisseld met de SHG bands, wat aangeeft dat ze halverwege gelegen tussen twee opeenvolgende M-bands, die samenviel met de locatie van de Z-lijnen. In getransfecteerde spiervezels gekleurd met di-8-ANEPPS, zijn α-actinine-EGFP bands gezien in het midden tussen elk paar van de T-tubuli (figuur 2F) waarvan bekend is dat flank van de Z-lijnen (dat wil zeggen gescheiden door een kortere afstand), dus aangeeft dat transgene α-actinine is gericht op de Z-lijn.
Expressie van DHPRα1s gelabeld aan de N-terminus met EGFP
De efficiëntie van spier transfectie met pEGFPC1.1-DHPR α 1s is geverifieerd TPLSM beelden (bijv. figuur 3A) waaruit blijkt dat de meeste vezels uitdrukken EGFP-DHPRα1s (een transmembraan eiwit). Het meest opvallende kenmerk van de getransfecteerde vezels is de dubbele gestreepte patroon van EGFP fluorescentie (Figuren 3A en 3B), zoals zou worden verwacht als dit eiwit was gericht op de T-tubuli. Het kan ook worden waargenomen in figuur 3 dat, hoewel verschillende vezels tonen verschillende niveaus van fluorescentie-intensiteit, de gestreepte fluorescentie patroon van een individuele vezel lijkt te worden gehandhaafd homogene langs de vezel. Bij hogere vergroting (figuur 3B), is duidelijk te zien dat de ongelijke afstand tussen de bands is vergelijkbaar met dat in de vezels gekleurd di-8-ANEPPS (bijv. figuur 2E). De overlay beelden (Figuur 3B & 3E) illustreren dat het SHG bands bevinden zich in de grotere afstand tussen EGFP-DHPRα1s bands, bevestigende dat dit eiwit is bij de T-tubuli. Extra FRET metingen met de niet-fluorescerende lipofiel anion DPA-(gegevens niet getoond) verder aan te tonen dat het EGFP-groep is binnen enkele nanometers van de innerlijke folder van de T-tubuli 'membranen.
Lokalisatie en functionele evaluatie van de expressie van EYFP-ClC1
Vezels getransfecteerd met pEYFP-ClC1, die een EYFP-tagged construct (aan de N-terminal) van de skeletspieren chloride kanaal (ClC1), display EYFP fluorescentie bands (Figuur 4A) codeert met een patroon vergelijkbaar met dat voor het EGFP-DHPRα1s 'expressie (Figuur 3A) en die overeenkomt met de T-tubulus regeling als geïllustreerd met di-8-ANEPPS aankleuring (figuur 2E). Zoals verwacht, de superpositie van EYFP-ClC1 (Figuur 4A) en de SHG's (Figuur 4B) zoals weergegeven in de overlay (Figuur 4C), illustreren dat het SHG bands zijn gecentreerd op de grote afstand of tussen EYFP fluorescentie bands.
Om te beoordelen of de uitdrukking van EYFP-ClC1 resulteert in een significante toename van de rust geleiding van de spiervezels, die verwacht worden van de overexpressie van functionele chloride kanalen, we enzymatisch los spiervezels van de getransfecteerde FDB spieren en hun elektrofysiologische eigenschappen bestudeerd met behulp van een twee-micro-elektroden experimentele opstelling eerder beschreven 6,11,13. Figuur 5 toont de resultaten van twee vezels: een expressie van grote hoeveelheden EYFP-ClC1 zoals beoordeeld door de wereldwijde fluorescentie-intensiteit metingen in een standaard fluorescentie microscoop (niet getoond), en de andere is een niet-getransfecteerde controle. De spanning record in figuur 5A (verkregen uit de spiervezels uiten EYFP-ClC1) laat zien dat als gevolg van de excessieve rust geleiding, de vezel is bijna niet opgewonden. Momenteel zorgt de pulsen van maximaal 400nA (0,5 ms) die nodig is om te worden gebruikt om een zeer kleine actieve respons (geen overshoot, figuur 5A) te lokken. Na het vervangen van de externe Tyrode oplossing om een met 500 pM van het chloride-blokker 9-ACA, 200 nA stroompulsen voldoende waren om een actie potentiaal (Figuur 5B) te lokken, maar veel langzamer en breder zijn dan die opgenomen in de controle-vezel ( figuur 5C). Zoals verwacht, de toevoeging van negen-ACA heeft minimale effecten op deze controle vezel (Figuur 5D).
Figuur 1. Transfectie-efficiëntie van de in-vivo elektroporatie methode. Helderveld (A) en fluorescentie (B) beelden van een FDB spier getransfecteerd met PMR-mCherry. Dagen na de elektroporatie protocol: 12 dagen. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1.
Figuur 2. Expressie en targeting van α-actinine-EGFP in FDB vezels. Panelen A en B zijn EGFP-fluorescentie en SHG beelden, respectievelijk van een vezel te drukken α-actinine-EGFP. Panel C is een superpositie van de beelden in A en B. Panels D en E zijn fluorescentie beelden van een andere vezel te drukken α-actinine-EGFP en gekleurd met di-8-ANEPPS, respectievelijk. Paneel F is de superpositie van beelden in D en E. dagen na elektroporatie protocol: 6 dagen.
Figuur 3. Expressie en targeting van EGFP-DHPRα1s in FDB vezels. Paneel A, EGFP fluorescentie beeld van een groep van vezels te drukken EGFP-DHPRα1s. Panel B is een uitbreiding van het plein in paneel A om beter tonen de gestreepte patroon van de eiwitexpressie. Paneel C is de SHG afbeelding die overeenkomt met het beeld in paneel A. Panel D is de overlay van de beelden A en C. Panel E is een uitbreiding van het aangegeven gebied in paneel D. dagen na elektroporatie protocol: 20 dagen.
Figuur 4. Expressie en targeting van EYFP-ClC1 in FDB vezels. Panelen A en B zijn EYFP fluorescentie en SHG beelden, respectievelijk van vezels te drukken EYFP-ClC1. Paneel C is de superpositie van de beelden in panelen A en B. Panel D is een intensiteit profiel gemeten langs de witte lijn gemarkeerd in de afbeelding in paneel C. dagen na elektroporatie protocol: 7 dagen.
Figuur 5. Electrofysiologische beoordeling vezels uiten van transgene EYFP-ClC1. Panelen A en B zijn spanning records uit een vezel te drukken EYFP-ClC1 in reactie op de huidige pulsen voor en na behandeling met 9-ACA, respectievelijk. Panelen C en D zijn spanning records (actiepotentialen) veroorzaakte in reactie op de huidige pulsen in een niet-getransfecteerde vezels voor en na behandeling met 9-ACA, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier de gedetailleerde stappen die gevolgd moeten worden om een doeltreffende transfecties van DNA plasmiden te bereiken in de skeletspier vezels door in vivo elektroporatie. De belangrijkste voordelen van onze aanpak zijn de eenvoud van de uitvoering, en de minimale invasiviteit, wat resulteert in verwaarloosbare gezondheidsrisico voor de dieren. In werkelijkheid, zijn de hierboven beschreven elektroporatie protocollen niet leiden tot veel meer dan twee subcutane injecties per voet, gevolgd door een elektrische stimulatie protocol, die allemaal goed verdragen door de dieren onder narcose. In onze instelling deze manipulaties zijn helemaal vastbesloten om niet-chirurgische ingrepen, omdat zij niet betrokken zijn bij het openen van de huid. Trouwens, de mildheid van de elektroporatie procedures is een kritische factor voor het algehele succes in het bereiken van een efficiënte plasmide transfectie en de daaropvolgende eiwitexpressie door de spiervezels aangezien elke cel significante schade zou hun vermogen om efficiënt te nemen aan actieve eiwitsynthese beïnvloeden.
Kleine aanpassingen aan de procedures die hier beschreven kan worden (en zijn) uitgevoerd voor grotere spieren van de muis voet (bijv. extensor digitorum longus, EDL, tibialis anterior, TA, en, soleus spieren). Bovendien, door gewoon het opschalen van de totale hoeveelheid DNA, hebben we de precieze procedures beschreven om de FDB en IO-spieren van volwassen ratten transfecteren met groot succes.
Hoewel de transfectie protocollen consequent resulteren in een variabele mate van expressie van transgene eiwitten door spiervezels, kan deze worden benut in fysiologische experimenten, niet-expressie vezels kunnen gebruikt worden als controle, en vezels met een verschillende mate van expressie kan worden gebruikt om de correleren het niveau van expressie met het niveau van functie te veranderen. Ook zijn CMV promotors zijn geschikt bevonden worden in waardoor hoge niveaus van eiwitexpressie, andere spier-specifieke promotors kan de werkzaamheid van eiwitexpressie te verbeteren. Opgemerkt moet worden dat wanneer het niet mogelijk is (of handig) om fluorescent-gelabelde eiwitten constructies in spiervezels uit te drukken, zijn we erin geslaagd in het uiten van niet-gelabelde eiwitten en bewaken van het niveau van expressie met bicistronische plasmiden die gelijktijdig coderen voor een fluorescerend eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken dr. T. Otis, afdeling Neurobiologie, UCLA, voor het delen van de TPLSM faciliteit met ons, dr. C. Fahlke, Instituut voor Fysiologie, RWTH Aachen, Duitsland, voor het soort schenking van de pEYFP-ClC1 plasmide, en de heer . R. Serrano voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van NIH / NIAMS beurzen AR047664 en AR54816.
References
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).
- DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system. Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).
- Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons. Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle. Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).
- DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).
- Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy. J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres. Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).
- DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS. J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).
- Mills, M. Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).
