Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

DNA Transfektion av däggdjurs Skelettmuskulatur hjälp In Vivo Elektroporation

doi: 10.3791/1520 Published: October 19, 2009

Summary

Vi beskriver detaljerade förfaranden för effektiv transfektion av plasmid-DNA i fibrerna av mul muskler av levande möss med elektroporation och den efterföljande visualisering av protein uttryck med hjälp av fluorescensmikroskopi.

Abstract

Ett växande intresse för cellbiologi är att uttala transgenically modifierade former av viktiga proteiner (till exempel fluorescerande taggade konstruerar och / eller mutant varianter) för att undersöka deras endogena distribution och funktionell relevans. En intressant metod som har genomförts för att uppfylla detta mål fullt differentierade celler är

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Experimentella Rutiner för in vivo-elektroporering i FDB och IO muskler

  1. Innan in vivo elektroporering protokoll måste däggdjur uttryck plasmider förstärkas för att ge koncentrationen i intervallet på 2-5 mikrogram plasmid / l av TE. OBS: Vi rutinmässigt använder kommersiella förstärkning kit och följ tillverkarens förfaranden. Kommersiella uttryck plasmider som bär CMV promotor fungerar mycket bra i skelettmuskulatur in vivo transfections.
  2. Alikvotera nödvändiga volym (10-20 l) av plasmiden lösningen och spara den i två 0,5 ml Eppendorf-rör (en för varje fot av musen).
  3. Bered en lösning innehållande 2 mg / ml hyaluronidas i sterila Tyrode.
  4. Använda en anesthetizing rutan djupt söva en mus med 4% isofluran hos O2 med en godkänd gas anestesiapparaten. Placera djuret på en värmedyna (37 ° C) och underhålla anestesi med mask gnagare ansikte. Övervaka anestetiska djupet av tå nypa reflex.
  5. Under observation med en dissektion mikroskop, injicera 10 mikroliter av hyaluronidas lösning under trampdynorna på ena foten på musen med hjälp av en 1 "lång 33 gauge steril kanyl. Penetrera huden vid en punkt nära hälen och gå vidare nålen subkutant mot basen på tårna för ~ 1 / 4 ".
  6. Upprepa proceduren med den andra foten om så önskas.
  7. Koppla bort anestesi och placera musen i en bur. Låt den återhämta sig helt från narkos.
  8. Efter en timme, söva djuret för andra gången och placera den på värmedyna. Enligt samma förfarande som beskrivs för hyaluronidas lösningen, injicera totalt 20-50 mikrogram av plasmid-DNA (beroende på storleken på plasmiden konstruera). Den totala injektionsvolym bör vara mindre än 20 l / fot. OBS: när 15-20 μ L är nödvändigt, är det lämpligt att stänga huden på nålen inkörsporten med vävnad-lim.
  9. Koppla bort anestesi och placera musen i en bur. Låt den återhämta sig helt från anestesi och vänta i 10-15 min.
  10. Bedöva djuret för tredje gången och placera den på värmedyna.
  11. Välj en fot av djuret. Placera en guldpläterad akupunkturnål under huden på hälen, och en andra på basen av tårna. Elektroder är orienterade parallellt med varandra och vinkelrätt mot den långa axeln av foten.
  12. Anslut chef för nålar (elektroder) till den elektriska stimulatorn med hjälp av mikro-klipp kontakter. Electroporate musklerna genom att tillämpa 20 pulser, 20 ms i längd / st vid 1Hz. Beroende på avståndet mellan elektroderna är pulser "spänningsamplituden justeras (genom övervakning med ett oscilloskop) för att erhålla ett elektriskt fält på ~ 100 V / cm. OBS: Inga sammandragningar som svar på stimuli ska observeras om nivån på anestesi är tillräcklig.
  13. Om så önskas, upprepa ovanstående förfaranden i kontralaterala foten av djuret.
  14. Tillbaka djuret till sin bur och en gång återhämtat sig helt från narkos behålla den under observation. Obs: om proceduren gick normalt, bör djuret återfå full rörlighet inom 30 minuter och därefter är redo att skickas tillbaka till djuret rum på vivarium. Den injektioner av hyaluronidas och DNA i trampdynorna inte har märkbara negativa effekter på djuren. När återhämtat sig från anestesi, möss kan lunka normalt runt buren. Som en extra försiktighetsåtgärd, lägga till dricksvatten av djuret Karprofen på 0,0027 mg / ml för 2 dagar som ett smärtstillande medel.
  15. Protein uttryck kan analyseras 2-8 dagar efter transfektion. Har dock fortsatt uttryck av många proteiner har observerats i flera månader.

OBS: Alla djur har godkänt förfarandena UCLA kanslerns djurförsök kommitté som på uppdrag av djurskyddslagen och PHS Policy för mänsklig omsorg och användning av försöksdjur.

Representativa resultat:

Ett korrekt genomförande av in vivo elektroporering förfaranden som beskrivs ovan bör resultera i effektiva transfektion av plasmider i FDB och IO muskler. Kommer dock effektiviteten i uttryck av transgena proteiner varianter beror på plasmiden, storlek och komplexitet protein, funktionella egenskaper protein, och ett antal andra variabler utanför vår kontroll. Som illustreras i figur 1 för en FDB muskel electroporated i närvaro av en kommersiell plasmid (PMR-mCherry) kodning för mCherry protein, är de flesta av muskelfibrer transfekterade med våra protokoll, vilket illustreras av det faktum att de flesta av dem visas röd fluorescens. Detta utesluter inte möjligheten att enskilda fibrer uppvisar olika grader av proteinuttryck, eller att få fibrer inte transfekterade alls 3. Det ska be noterade att effektiv uttryck för stora mängder av fluorescerande proteiner såsom mCherry, EGFP, ECFP och EYFP, inte försämra muskelfibrerna "retbarhet och excitation-kontraktion egenskaper koppling. I själva verket är de identiska med dem i falska transfekterade musklerna (resultat visas inte).

Praktiska metoder som används för att kontrollera lokala uttryck för fluorescerande-taggade proteiner i skelettmuskulaturen fibrer.

Den intracellulära lokaliseringen av DI uttryckt novo transgena proteiner är rutinmässigt utvärderas av samtidiga förvärva, använda TPLSM, fluorescerande bilder av respektive taggar och bilder på väl identifierade markörer för cellulära strukturer. Det mest typiska av dessa sistnämnda är: a) andra övertonen generationen (SHG) bilder, som uppkommer vid myosin anisotropi av sarcomeric A banden (centrerad på M-linjerna) 9,10, och b) di-8-ANEPPS fluorescens bilder, som kan erhållas genom märkning ytan och tvärgående tubulär (T-tubuli) systemet membran av muskelfibrer med denna impermeant potentiometrisk dye11. I fluorescens bilder av muskelfibrer färgats med di-8-ANEPPS, T-tubuli visas som smala band av fluorescens orienterade ungefär vinkelrätt mot den långa axeln i fibern. Dessa band är ojämnt fördelade från varandra: de är åtskilda av en lång sträcka som spänner över hela M-linjer, och en kort en som spänner över hela Z-line 11.

Uttryck och lokalisering av α-actinin-EGFP i skelettmuskulatur fibrer.

Ett exempel på uttryck för en taggad variant av den strukturella muskelprotein α-actinin visas i figur 2. Detta protein är känt för att vara en viktig del av Z-line och som sådan rutinmässigt används som en markör för detta structure12. Vi transfekterade FDB och IO muskler med hjälp av plasmiden pEGFPN1-α-actinin1 kodning för mänskliga (icke-muskel) α-actinin taggade på C terminalen med EGFP. Sex dagar efter transfektion, fann vi att, som bedöms av EGFP fluorescens distribution, α-actinin oftast uttryckt i smala band jämnt fördelade längs fibern axeln. En enda band per sarcomere ses (figur 2A och 2D). Den colocalization av dessa band med Z-raderna framgår genom att jämföra fördelningen av EGFP fluorescens med SHG (Figur 2B) och di-8-ANEPPS (Figur 2E) bilder. Som framgår av overlay bild (figur 2C), α-actinin-EGFP band omväxlande med SHG band, vilket indikerar att de ligger mitt emellan två på varandra följande M-band, vilket sammanföll med placeringen av Z-linjer. I transfekterade muskelfibrer färgats med di-8-ANEPPS är α-actinin-EGFP banden sett centrerad mellan varje par av T-tubuli (Figur 2F) som är kända för flanken Z-linjer (dvs. åtskilda av en kortare sträcka), vilket visar att transgena α-actinin är riktad till Z-line.

Redovisning av DHPRα1s taggade vid N-terminalen med EGFP

Effektiviteten i muskeln transfektion med pEGFPC1.1-DHPR α 1s har verifierats i TPLSM bilder (t.ex. figur 3a) visar att de flesta fibrer uttrycka EGFP-DHPRα1s (en transmembranös protein). De mest framträdande inslag i transfekterade fibrer är den dubbla bandade mönster av EGFP fluorescens (figur 3A och 3B) som väntat om detta protein var riktad till T-tubuli. Det kan också observeras i figur 3 att medan olika fibrer visa olika nivåer av fluoroscensintensitet verkar banded fluorescens mönster av en enskild fiber hållas homogen längs med fibrerna. Vid högre förstoring (figur 3B), kan man tydligt se att den ojämna avstånd mellan banden liknar den som observerats i fibrer betsad di-8-ANEPPS (t.ex. Figur 2E). Överlägget bilderna (Figur 3B & 3E) illustrerar att SHG banden ligger inom det större avståndet mellan EGFP-DHPRα1s band, bekräftar att detta protein är vid T-tubuli. Ytterligare FRET mätningar med icke-fluorescerande lipofilt anjon DPA-(data inte visas) ytterligare visa att EGFP fraktion är inom några nanometer i det inre bipacksedel av T-tubuli "membran.

Lokalisering och funktionell utvärdering av uttrycket av EYFP-ClC1

Fibrer transfererats med pEYFP-ClC1, som kodar ett EYFP-märkta konstruera (vid N-terminalen) av skelettmuskulaturen kloridkanalen (ClC1), visa EYFP fluorescens band (Figur 4A) med ett liknande mönster som observerats för EGFP-DHPRα1s "uttryck (Figur 3A) och motsvarande till T-tubuli arrangemang som illustreras med di-8-ANEPPS färgning (Figur 2E). Som väntat överlagring av EYFP-ClC1 (Figur 4A) och SHG bilder (Figur 4B) som visas i överlägget (Figur 4C) visar att SHG banden är centrerade på stora avstånd of mellan EYFP fluorescens band.

För att kunna bedöma om uttrycket av EYFP-ClC1 resulterar i en betydande ökning av vilande värmeledningsförmåga muskelfibrer, som väntat från överuttryck av funktionella kloridjonkanaler, studerade vi enzymatiskt dissocierade muskelfibrer från transfekterade FDB muskler och deras elektrofysiologiska egenskaper med en två-microelectrodes experimentuppställning beskrivits tidigare 6,11,13. Figur 5 visar resultaten från två fibrer: ett uttryck för stora mängder EYFP-ClC1 enligt bedömning från globala fluorescensintensiteten mätningar i en standard fluorescensmikroskop (visas inte), och den andra är en icke-transfekterade kontroll. Spänningen rekord i figur 5A (från muskelfiberstrukturen uttrycka EYFP-ClC1) visar att på grund av den överdrivna vila konduktans är fiber nästan icke-lättretlig. Aktuell stimulans pulser upp till 400nA (0.5ms) behövde användas för att framkalla en mycket liten aktiv respons (Inga överskrids Figur 5A). Efter byte av den externa Tyrode lösning till ett som innehåller 500 mikroM av klorid-blockerare 9-ACA var 200 nA strömpulser tillräckligt för att framkalla en aktionspotential (Figur 5B), men mycket långsammare och bredare än de som registrerats i kontrollgruppen fiber ( Figur 5C). Som väntat hade tillägg av 9-ACA minimal inverkan på denna kontroll fiber (Figur 5D).

Figur 1
Figur 1. Transfektion effektivitet i in-vivo elektroporering metod. Brightfield (A) och fluorescens (B) bilder av en FDB muskel transfererats med PMR-mCherry. Dagar efter elektroporation protokollet: 12 dagar. Vänligen klicka här för en större version av figur 1.

Figur 2
Figur 2. Uttryck och inriktning av α-actinin-EGFP i FDB fibrer. Paneler A och B är EGFP fluorescens och SHG bilder, respektive av en fiber som uttrycker α-actinin-EGFP. Panel C är en överlagring av bilder i A och B. paneler D och E är fluorescens bilder av en annan fiber som uttrycker α-actinin-EGFP och färgas med di-8-ANEPPS, respektive. Panel F är överlagring av bilder i D och E. dagarna efter elektroporation protokollet: 6 dagar.

Figur 3
Figur 3. Uttryck och inriktningen av EGFP-DHPRα1s i FDB fibrer. Panel A, EGFP fluorescens bild av en grupp av fibrer uttrycka EGFP-DHPRα1s. Panel B är en utvidgning av torget i panel A för att bättre visa den bandade mönstret i proteinuttryck. Panel C är SHG bilden motsvarar bilden i panelen A. Panel D är en överlagring av bilderna A och C. Panel E är en utvidgning av det område som anges i panelen D. dagar efter elektroporation protokollet: 20 dagar.

Figur 4
Figur 4. Uttryck och inriktningen av EYFP-ClC1 i FDB fibrer. Paneler A och B är EYFP fluorescens och SHG bilder, respektive av fibrer uttrycka EYFP-ClC1. Panel C är överlagring av bilderna i panelerna A och B. Panel D är en intensitet profil mätt längs den vita linjen markerade i bilden i panel C. dagar efter elektroporation protokollet: 7 dagar.

Figur 5
Figur 5. Elektrofysiologiska bedömning fibrer uttrycka transgena EYFP-ClC1. Paneler A och B är spänningen poster från en fiber som uttrycker EYFP-ClC1 svar på strömpulser före och efter behandling med 9-ACA, respektive. Paneler C och D är spänning poster (aktionspotentialer) framkallade ett svar på strömpulser i en icke-transfekterade fiber före och efter behandling med 9-ACA, respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi beskriver här de detaljerade steg som bör följas för att uppnå en effektiv transfections av DNA plasmider i skelettmuskulaturen fibrer av in vivo-elektroporering. De största fördelarna med vår strategi är enkelheten i genomförandet, och dess minimala invasiv vilket resulterar i försumbar hälsorisk för djuren. I verkligheten innebär de ovan beskrivna elektroporation protokollen inte mycket mer än två subkutana injektioner per fot, följt av en elektrisk stimulering protokoll, som alla är väl tolereras av djur under narkos. I vår institution dessa manipulationer är helt och hållet bestämt sig för att vara icke-kirurgiska ingrepp eftersom de inte innebär öppnandet av huden. Dessutom är mildhet elektroporation förfaranden en kritisk faktor för den övergripande framgång i att uppnå en effektiv plasmiden transfektion och den efterföljande proteinuttryck av muskelfibrerna sedan någon betydande cellskador inskränker deras förmåga att effektivt bedriva aktiv proteinsyntesen.

Smärre justeringar av de förfaranden som beskrivs här kan vara (och har) genomfört för större muskler av musen foten (t.ex. extensor digitorum longus, EDL, tibialis anterior, TA, och soleus muskler). Vidare genom att bara skala upp den totala mängden DNA, har vi genomfört den exakta förfaranden som beskrivs här för att transfektera FDB-och IO musklerna vuxna råttor med stor framgång.

Även transfektion protokoll konsekvent resulterar i en varierande grad av uttrycket av transgena proteiner av muskelfibrer, kan detta tas tillvara i fysiologiska experiment, icke-uttryckande fibrer kan användas som kontroller, och fibrer med olika nivå av uttryck kan användas för att korrelera graden av uttryck med den nivå av funktion förändras. Dessutom har CMV initiativtagare konstaterats vara lämplig i ger höga nivåer av proteinuttryck, andra muskel-specifika projektansvariga kan förbättra effekten av protein uttryck. Det bör noteras att när det inte är möjligt (eller lämpligt) för att uttrycka fluorescerande-taggade proteinet konstruktioner i muskelfibrer, har vi lyckats uttrycka omärkta proteiner och övervaka nivån av uttryck med bicistronic plasmider som samtidigt koda ett fluorescerande protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi tackar Dr T. Otis, Institutionen för neurobiologi, UCLA, för att dela TPLSM anläggningen med oss, Dr C. Fahlke, Institutet för fysiologi, RWTH Aachen, Tyskland, för den typ donation av pEYFP-ClC1 plasmid, och herr . R. Serrano för teknisk support. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH / NIAMS bidrag AR047664 och AR54816.

References

  1. Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20, (2), 145-151 (2002).
  2. DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 130, (6), 581-600 (2007).
  3. DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system. Protein Expression and Purification. 47, (1), 281-288 (2006).
  4. Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons. Neuropharmacology. 49, (6), 883-889 (2005).
  5. DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle. Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).
  6. Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).
  7. DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (38), 14698-14703 (2008).
  8. Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy. J. Gen. Physiol. 129, (1), 79-94 (2007).
  9. Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, (12), 7075-7080 (2003).
  10. Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres. Biophys J. 90, (2), 693-703 (2006).
  11. DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS. J Membr Biol. 208, (2), 141-153 (2005).
  12. Mills, M. Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10, (13), 1335-1346 (2001).
  13. Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).
DNA Transfektion av däggdjurs Skelettmuskulatur hjälp<em> In Vivo</em> Elektroporation
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (32), e1520, doi:10.3791/1520 (2009).More

DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (32), e1520, doi:10.3791/1520 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter