DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

Summary

Wir beschreiben detaillierte Verfahren für die effiziente Transfektion von Plasmid-DNA in die Fasern der Fußmuskulatur von lebenden Mäusen mittels Elektroporation und der nachfolgenden Darstellung der Proteinexpression mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.

Abstract

Ein wachsendes Interesse in der Zellbiologie ist transgen zu veränderten Formen der essentiellen Proteine ​​(zB fluoreszenzmarkierten Konstrukte und / oder mutierte Varianten) auszudrücken, um ihre endogene Verteilung und funktionelle Bedeutung zu untersuchen. Ein interessanter Ansatz, der umgesetzt wurde, um dieses Ziel in ausdifferenzierten Zellen erfüllen, ist der

Protocol

Experimentelle Verfahren zur in-vivo-Elektroporation von FDB und IO Muskeln

1. Vor Beginn der in vivo Elektroporation Protokolle müssen Säugetieren Expressionsplasmide verstärkt um die Konzentration im Bereich von auf 2-5 pg Plasmid / ul TE Hinweis ergeben werden:. Wir verwenden routinemäßig kommerzielle Verstärkung Kits und folgen Sie den Hersteller "Verfahren. Gewerbliche Expressionsplasmide Durchführung der CMV-Promotor arbeiten sehr gut im Skelettmuskel in vivo Transfektionen.
2. Aliquot das notwendige Volumen (10-20 ul) der Plasmid-Lösung und speichern Sie sie in zwei 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen (eine für jeden Fuß der Maus).
3. Bereiten Sie eine Lösung mit 2 mg / ml Hyaluronidase in sterile Tyrode.
4. Mit einer Betäubung Feld tief betäuben eine Maus mit 4% Isofluran in O2 mit einem zugelassenen Gas-Narkosegerät. Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen (37 ° C) und Aufrechterhaltung der Narkose mit einem Nagetier Gesichtsmaske. Überwachen Sie die Narkosetiefe durch toe Prise Reflex.
5. Unter Beobachtung mit einem Dissektionsmikroskop, injizieren 10 ul der Hyaluronidase-Lösung unter dem Fußballen von einem Fuß der Maus über einen 1 "langen 33 gauge sterile Nadel. Dringen in die Haut an einer Stelle nahe der Ferse des Fußes und vorab die Nadel subkutan in Richtung der Basis der Zehen für ~ 1 / 4 ".
6. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Fuß, wenn dies gewünscht wird.
7. Trennen Sie die Anästhesie und die Maus in einem Käfig. Lassen Sie es vollständig aus der Narkose zu erholen.
8. Nach einer Stunde, betäuben das Tier ein zweites Mal und legen Sie es auf dem Heizkissen. Nach dem gleichen Verfahren für die Hyaluronidase beschriebene Lösung injizieren insgesamt von 20-50 ug der Plasmid-DNA (je nach Größe der Plasmid-Konstrukt). Die gesamte Injektionsvolumen sollte weniger als 20 ul / Fuß. Hinweis: wenn 15-20 μ L erforderlich ist, ist es ratsam, die Haut an der Einstichstelle in der Nähe mit Gewebe-Kleber.
9. Trennen Sie die Anästhesie und die Maus in einem Käfig. Lassen Sie es vollständig aus der Narkose zu erholen, und warten Sie 10-15 min.
10. Anesthetize das Tier bereits zum dritten Mal und legen Sie es auf dem Heizkissen.
11. Wählen Sie einen Fuß des Tieres. Legen Sie eine vergoldete Akupunkturnadeln unter die Haut an der Ferse, und eine zweite an der Basis der Zehen. Elektroden sind parallel zueinander und senkrecht zur Längsachse des Fußes.
12. Verbinden Sie den Kopf der Nadeln (Elektroden) mit dem elektrischen Stimulator mit Mikro-Clip-Anschlüsse. Elektroporieren die Muskeln, indem 20 Impulse, 20 ms Dauer / Stück, bei 1Hz. Je nach Abstand der Elektroden, die Impulse 'Spannungsamplitude eingestellt (durch die Überwachung mit einem Oszilloskop), um ein elektrisches Feld von ~ 100 V / cm Hinweis ergeben:. Keine Kontraktionen in Reaktion auf die Reize zu beachten, wenn das Niveau der Anästhesie ist ausreichend.
13. Wenn es gewünscht wird, wiederholen Sie die oben genannten Verfahren in der kontralateralen Fuß des Tieres.
14. Zurück das Tier in den Käfig und einmal vollständig aus der Narkose erholt halten sie unter Beobachtung. Hinweis: wenn das Verfahren verlief normal, das Tier sollte die volle Mobilität innerhalb von 30 Minuten wieder und danach ist bereit, zurück zu dem Tier Zimmer im Vivarium gesendet werden. Die Injektion von Hyaluronidase und DNA in den Fußsohlen haben keine spürbaren negativen Auswirkungen auf die Tiere. Einmal aus der Narkose erholt, werden die Mäuse in der Lage, normal zu schlendern um den Käfig. Als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um das Trinkwasser der Tiere Carprofen bei 0,0027 mg / ml für 2 Tage als Analgetikum hinzuzufügen.
15. Protein Expression kann 2-8 Tage nach der Transfektion untersucht werden. Allerdings hat anhaltende Expression vieler Proteine ​​über Monate beobachtet worden.

HINWEIS: Alle tierischen Verfahren wurden von der UCLA Kanzlers Animal Research Committee genehmigt durch das Tierschutzgesetz und die PHS-Politik auf Humane Pflege und Verwendung von Labortieren vorgeschrieben.

Repräsentative Ergebnisse:

Die korrekte Umsetzung der in vivo Elektroporation oben beschriebenen Verfahren sollte in der effektiven Transfektion von Plasmiden in FDB und IO Muskeln führen. Doch die Effizienz der Expression von transgenen Proteinen Varianten werden auf dem Plasmid abhängen, der Größe und Komplexität des Proteins, die funktionellen Eigenschaften des Proteins, und eine Reihe von anderen Variablen außerhalb unserer Kontrolle. Wie in Abbildung 1 für eine FDB Muskel in Gegenwart von einem kommerziellen Plasmid (PMR-mCherry) Codierung für mCherry Protein elektroporiert dargestellt, sind die meisten der Muskelfasern mit unserem Protokoll transfiziert, wie durch die Tatsache, das die meisten von ihnen Anzeige rote Fluoreszenz dargestellt. Dies schließt nicht aus, dass die einzelnen Fasern verschiedene Grade der Proteinexpression aufweisen, oder dass nur wenige Fasern sind nicht an allen 3 transfiziert. Es sollte be darauf hingewiesen, dass die effiziente Expression von großen Mengen von fluoreszierenden Proteinen wie mCherry, EGFP, ECFP und EYFP, beeinträchtigt nicht die Muskelfasern "Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion Eigenschaften. In der Tat sind sie nicht von denen in sham transfizierten Muskeln (Ergebnisse nicht gezeigt).

Praktische Ansätze verwendet, um die lokalisierte Expression von Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in Skelettmuskelfasern zu überprüfen.

Die intrazelluläre Lokalisation der di novo exprimierten transgenen Proteinen wird routinemäßig durch gleichzeitige Erwerb ausgewertet, mit dem TPLSM, fluoreszierende Abbildungen der jeweiligen Tags und Bilder von klar definierten Markern von zellulären Strukturen. Die typischsten dieser letzteren sind: a) Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Bilder, die aus dem Myosin Anisotropie der Sarkomer A-Bands (zentriert bei der M-Linien) 9,10 ergeben und b) di-8-ANEPPS Fluoreszenz Bilder, die durch die Kennzeichnung der Oberfläche und quer röhrenförmigen (T-Tubulus-System) Membranen der Muskelfasern mit diesem impermeante potentiometrische dye11 gewonnen werden können. In Fluoreszenzbilder von Muskelfasern mit di-8-ANEPPS gefärbt erscheinen die T-Tubuli als schmale Bänder von Fluoreszenz orientierten etwa senkrecht zur Längsachse der Faser. Diese Bänder sind ungleichmäßig voneinander beabstandet: sie sind durch eine lange Strecke, die über die M-Linien umfasst, und eine kurze, die über die Z-Linie ¹¹ erstreckt sich getrennt.

Expression und Lokalisation von α-Actinin-EGFP in Skelettmuskelfasern.

Ein Beispiel für den Ausdruck eines markierten Variante des strukturellen Muskelprotein α-Actinin ist in Abbildung 2 dargestellt. Dieses Protein ist dafür bekannt, eine wichtige Komponente der Z-Linie und als solche wird routinemäßig als Marker dieser structure12 verwendet. Wir transfizierten FDB und IO Muskeln mit dem Plasmid pEGFPN1-α-actinin1 Kodierung für die menschliche (nicht-Muskel) α-Actinin am C-Terminus mit EGFP markiert. Sechs Tage nach der Transfektion, fanden wir, dass, wie von EGFP-Fluoreszenz Verteilung, α-Actinin meist auf schmalen Bändern gleichmäßig entlang der Faserachse angeordnet ist Ausdruck bewertet. Ein einziges Band pro Sarkomer gesehen wird (2A und 2D). Die Kolokalisation von diesen Bands mit den Z-Linien wird durch den Vergleich der Verteilung der EGFP-Fluoreszenz mit der SHG (Abbildung 2B) und di-8-ANEPPS (Abb. 2E) Bilder gezeigt. Wie das Overlay-Bild (Abbildung 2C), α-Actinin-EGFP Bands wechseln sich ab mit dem SHG-Bands gezeigt, was darauf hinweist, dass sie auf halbem Weg zwischen zwei aufeinander folgenden M-Bänder befindet, zeitgleich mit der Lage der Z-Linien. In transfizierten Muskelfasern mit di-8-ANEPPS gebeizt, sind α-Actinin-EGFP-Bands gesehen, mittig zwischen jedem Paar von T-Tubuli (Abb. 2F), die Flanke des Z-Linien (dh durch eine kürzere Distanz getrennt) bekannt sind, was zeigt, dass transgene α-Actinin der Z-Linie wird angestrebt.

Expression von DHPRα1s am N-Terminus mit EGFP markiert

Die Effizienz der Muskel Transfektion mit pEGFPC1.1-DHPR α 1s ist in TPLSM Bilder (zB 3A) zeigt, dass überprüft meisten Fasern ausdrückliche EGFP-DHPRα1s (ein Transmembranprotein). Das auffälligste Merkmal von transfizierten Fasern ist das Doppel-gebändert Muster der EGFP-Fluoreszenz (3A & 3B) wie zu erwarten, wenn dieses Protein, um die T-Tubuli gezielt wurde. Es kann auch in Abbildung 3 zu beachten, dass zwar verschiedene Fasern verschiedenen Ebenen der Fluoreszenzintensität Display, die gebänderte Fluoreszenzmuster einer einzelnen Faser zu erhalten homogen entlang der Faser zu sein scheint. Bei höherer Vergrößerung (Abbildung 3B), ist deutlich zu erkennen sein, dass die ungleichmäßige Abstände zwischen den Bands ähnlich wie in Fasern gefärbt di-8-ANEPPS (z. B. Abbildung 2E) beobachtet wird. Die Overlay-Bilder (Abbildung 3B & 3E) zeigen, dass die SHG-Bands in den größeren Abstand zwischen den EGFP-DHPRα1s Bands befinden, untermauern, dass dieses Protein bei der T-Tubuli ist. Zusätzliche FRET-Messungen mit dem nicht-fluoreszierenden lipophilen Anion DPA-(Daten nicht gezeigt) zeigen weiterhin, dass die EGFP-Einheit innerhalb von wenigen Nanometern der inneren Flugblatt der T-Tubuli "Membranen.

Lokalisierung und funktionelle Beurteilung der Expression von EYFP-ClC1

Fasern mit pEYFP-ClC1, die ein EYFP-markierten Konstrukts (in der N-terminal) der Skelettmuskulatur Chlorid-Kanal (ClC1), Display EYFP Fluoreszenzbanden (Abbildung 4A) kodiert mit einem Muster ähnlich dem für EGFP-DHPRα1s beobachtet transfizierten "Expression (Abbildung 3A) und entsprechend der T-Tubulus Anordnung wie abgebildet mit di-8-ANEPPS Färbung (Abb. 2E). Wie zu erwarten, die Überlagerung von EYFP-ClC1 (Abbildung 4A) und SHG Bilder (Abbildung 4B) als in der Überlagerung (Abbildung 4C) dargestellt, zeigen, dass die SHG-Bands auf den großen Abstand o zentriert sindf zwischen EYFP Fluoreszenzbanden.

Um zu beurteilen, ob die Expression von EYFP-ClC1 führt zu einer deutlichen Erhöhung der Ruhe-Leitwert der Muskelfasern, wie aus der Überexpression von funktioneller Chlorid-Kanäle zu erwarten, wir enzymatisch gespalten Muskelfasern aus den transfizierten FDB Muskeln und ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften untersucht mit einem Zwei-Mikroelektroden Versuchsaufbau zuvor beschrieben ^6,11,13. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse von zwei Fasern: ein Ausdruck großer Mengen von EYFP-ClC1 als von der globalen Messungen der Fluoreszenzintensität in einem Standard-Fluoreszenzmikroskop (nicht dargestellt) beurteilt, und die andere ist eine nicht-transfizierten Kontrolle. Die Spannung Rekord in Abbildung 5A (aus der Muskelfaser Ausdruck EYFP-ClC1) zeigt, dass aufgrund der zu hohen Ruhe-Leitfähigkeit wird die Faser fast nicht erregbar. Aktuelle Reizimpulse von bis zu 400nA (0,5 ms) benötigt, um verwendet werden, um eine sehr kleine aktive Reaktion (kein Überschwingen, 5A) hervorzurufen. Nach dem Austausch des externen Tyrode-Lösung zu einem Gehalt von 500 uM des Chlorid-Kanal-Blocker 9-ACA wurden 200 nA Stromimpulse aus, um ein Aktionspotential (Abbildung 5B) zu entlocken, obwohl viel langsamer und breiter als diejenigen in der Kontrollgruppe Faser aufgenommen ( Abbildung 5C). Wie erwartet, hatte Zugabe von 9-ACA minimale Auswirkungen auf diese Kontrolle Faser (Abb. 5D).

Abbildung 1. Transfektionseffizienz der in-vivo Elektroporation Methode. Hellfeld (A) und Fluoreszenz (B) Bilder einer FDB Muskel mit PMR-mCherry transfiziert. Tage nach der Elektroporation Protokoll: 12 Tage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 1.

Abbildung 2. Expression und Ausrichtung der α-Actinin-EGFP in FDB-Fasern. Panels A und B sind EGFP Fluoreszenz-und SHG Bilder, jeweils aus einem Faser Ausdruck α-Actinin-EGFP. Panel C ist eine Überlagerung der Bilder in A und B. Panels D und E sind Fluoreszenzbilder einer anderen Faser Ausdruck α-Actinin-EGFP und gefärbt mit di-8-ANEPPS jeweils. Panel-F ist die Überlagerung der Bilder in D und E. Tage nach der Elektroporation Protokoll: 6 Tage.

Abbildung 3. Expression und Ausrichtung der EGFP-DHPRα1s in FDB-Fasern. Panel A, EGFP-Fluoreszenz Bild einer Gruppe von Fasern zum Ausdruck EGFP-DHPRα1s. Panel B ist eine Vergrößerung des Platzes in Panel A, um besser zeigen die gebänderte Muster der Proteinexpression. Panel C ist die SHG Bild entsprechend, um das Bild in Panel A. Panel D ist die Überlagerung der Bilder A und C. Panel E ist eine Erweiterung der Fläche in Panel D. Tage nach der Elektroporation Protokoll angegeben: 20 Tage.

Abbildung 4. Expression und Ausrichtung der EYFP-ClC1 in FDB-Fasern. Die Abbildungen A und B sind EYFP Fluoreszenz-und SHG Bilder, bzw. der Fasern zum Ausdruck EYFP-ClC1. Panel C ist die Überlagerung der Bilder in Abb. A und B. Panel D ist ein Intensitätsverlauf entlang der weißen Linie in das Bild in Panel C Tage nach der Elektroporation Protokoll markiert gemessen: 7 Tage.

Abbildung 5. Elektrophysiologische Beurteilung Fasern Ausdruck transgenen EYFP-ClC1. Panels A und B sind Spannung Datensätze aus einer Faser ausdrücken EYFP-ClC1 in Reaktion auf aktuelle Impulse vor und nach der Behandlung mit 9-ACA, jeweils. Panels C und D sind Spannung Datensätze (Aktionspotentiale) ausgelöst als Reaktion auf aktuelle Impulse in einem nicht-transfizierten Faser vor und nach der Behandlung mit 9-ACA, jeweils.

Discussion

Wir beschreiben hier die einzelnen Schritte, die folgten, um eine effektive Transfektion von DNA-Plasmiden in Skelettmuskelfasern erreichen durch in vivo Elektroporation werden sollte. Die wesentlichen Vorteile unseres Ansatzes sind die Einfachheit der Implementierung und ihrer minimalen Invasivität, die in vernachlässigbarer Gefahr für die Gesundheit der Tiere führt. In Wirklichkeit haben die oben beschriebene Elektroporation Protokolle nicht erfordert weit mehr als zwei subkutane Injektionen pro Fuß, durch eine elektrische Stimulation Protokoll, die alle von den Tieren unter Narkose gut vertragen gefolgt. In unserer Einrichtung diese Manipulationen sind insgesamt entschlossen, nicht-chirurgische Eingriffe werden, da sie nicht mit Eröffnung der Haut. Außerdem ist die Milde der Elektroporation Verfahren ein entscheidender Faktor für den Gesamterfolg bei der Erreichung eines effizienten Plasmid-Transfektion und die anschließende Proteinexpression durch die Muskelfasern seit nennenswerte Zellschäden ihre Fähigkeit, effizient in aktive Proteinsynthese engagieren beeinträchtigen würde.

Kleinere Anpassungen an den hier beschriebenen Verfahren können (und wurden) für größere Muskeln der Maus Fuß (zB extensor digitorum longus, EDL, tibialis anterior, TA, und Soleus) implementiert. Darüber hinaus nur durch Aufstockung der Gesamtbetrag der DNA, haben wir die genauen Verfahren hier beschrieben, um die FDB und IO Muskeln der erwachsenen Ratten, die mit großem Erfolg umgesetzt transfizieren.

Obwohl Transfektion Protokolle konsequent in eine variable Höhe der Expression des transgenen Proteine ​​durch Muskelfasern führen, kann dies in Anspruch genommen werden in physiologischen Experimenten, nicht-exprimierende Fasern können als Kontrollen verwendet werden, und Fasern mit unterschiedlichen Niveau der Ausdruck kann verwendet werden, um zu korrelieren die Höhe der Expression mit dem Grad der Funktion zu ändern. Außerdem haben CMV Promotoren gefunden worden zu sein und hohe Gewinne auf Ebene der Proteinexpression, andere Muskel-spezifische Promotoren die Wirksamkeit von Protein-Expression verbessern kann geeignet. Es sollte angemerkt werden, dass, wenn es nicht möglich ist (oder bequemer), um Fluoreszenz-markierten Protein-Konstrukten in Muskelfasern auszudrücken, haben wir in Ausdruck unmarkierten Proteinen gelungen und überwachen die Höhe der Expression mit bicistronischen Plasmide, die gleichzeitig kodieren für ein fluoreszierendes Protein.