Transfection d'ADN des mammifères muscles squelettiques à l'aide In Vivo L'électroporation

Summary

Nous décrivons des procédures détaillées pour la transfection efficace de l'ADN plasmidique dans les fibres des muscles du pied des souris vivantes en utilisant l'électroporation et la visualisation ultérieure de l'expression des protéines en utilisant la microscopie à fluorescence.

Abstract

Un intérêt croissant pour la biologie cellulaire est d'exprimer des formes modifiées transgénique de protéines essentielles (par exemple les constructions fluorescence marqués et / ou de variants mutants) afin d'étudier leur distribution endogène et de la pertinence fonctionnelle. Une approche intéressante qui a été mis en œuvre pour atteindre cet objectif dans les cellules complètement différenciées est le

Protocol

Procédures expérimentales pour l'électroporation in vivo de muscles FDB et IO

1. Avant de commencer l'électroporation in vivo dans des protocoles, des plasmides d'expression mammifère doit être amplifié pour produire de concentration dans la gamme de à 2-5 mg Remarque plasmidique / ul de TE:. Nous utilisons régulièrement des kits d'amplification commerciaux et suivre les procédures du fabricant. Plasmides d'expression commerciaux transportant le travail promoteur CMV très bien dans le muscle squelettique de transfections in vivo.
2. Aliquoter le volume nécessaire (10-20 pi) de la solution de plasmide et l'enregistrer dans deux tubes de 0,5 ml Eppendorf (une pour chaque pied de la souris).
3. Préparer une solution contenant 2 mg / ml de hyaluronidase dans le Tyrode stérile.
4. Utiliser une boîte anesthésier, profondément anesthésier une souris utilisant 4% d'isoflurane en O2 avec une machine à gaz anesthésique approuvé. Placez l'animal sur un coussin chauffant (37 ° C) et de maintenir l'anesthésie avec un masque facial chez les rongeurs. Surveiller la profondeur de l'anesthésie par réflexe pincement de l'orteil.
5. Sous observation avec un microscope à dissection, injecter 10 ul de la solution de hyaluronidase sous les coussinets d'un pied de la souris en utilisant une 1 "de long aiguille de calibre 33 stérile. Pénètrent dans la peau à un point proche du talon du pied et de faire avancer l'aiguille sous la peau vers la base des orteils pour ~ 1 / 4 ".
6. Répétez la procédure avec l'autre pied s'il le désire.
7. Débranchez l'anesthésie et le lieu de la souris dans une cage. Laissez-le se remettre complètement de l'anesthésie.
8. Après une heure, anesthésier l'animal pour une deuxième fois et le placer sur le coussin chauffant. Suivant la même procédure décrite pour la solution de hyaluronidase, injecter un total de 20-50 pg de l'ADN plasmidique (selon la taille de la construction plasmidique). Le volume d'injection totale devrait être inférieure à 20 pl / pied. Remarque: lorsque L μ 15-20 est nécessaire, il est conseillé de fermer la peau au point d'entrée d'aiguille avec le tissu de la colle.
9. Débranchez l'anesthésie et le lieu de la souris dans une cage. Laissez-le se remettre complètement de l'anesthésie et d'attendre 10-15 minutes.
10. Anesthésier les animaux pour la troisième fois et le placer sur le coussin chauffant.
11. Sélectionnez un pied de l'animal. Placez une aiguille d'acupuncture plaqué or sous la peau au niveau du talon, et un second à la base des orteils. Les électrodes sont orientés parallèlement les uns aux autres et perpendiculaires à l'axe longitudinal du pied.
12. Connectez la tête des aiguilles (électrodes) au stimulateur électrique à l'aide de micro-clip connecteurs. Électroporation les muscles en appliquant des impulsions 20, 20 ms en durée / chacune, à 1Hz. Selon l'espacement des électrodes, l'amplitude de la tension des impulsions 'est ajustée (en surveillant avec un oscilloscope) pour donner un champ électrique de ~ 100 Note V / cm:. Pas de contractions en réponse à des stimuli doit être observée si le niveau de L'anesthésie est adéquat.
13. Si désiré, répétez la procédure ci-dessus dans le pied controlatéral de l'animal.
14. Retour à l'animal de sa cage et une fois complètement récupéré de l'anesthésie le maintenir sous observation. Note: si la procédure a normalement, l'animal devrait retrouver une mobilité complète dans les 30 minutes et est ensuite prêt à être renvoyé à la salle des animaux à la vivarium. Les injections de hyaluronidase et de l'ADN dans les coussinets plantaires n'ont pas perceptibles des effets néfastes sur les animaux. Une fois remis de l'anesthésie, les souris sont capables de déambuler normalement autour de la cage. Comme précaution supplémentaire, ajouter à l'eau potable de l'animal au carprofène 0,0027 mg / ml pendant 2 jours comme un analgésique.
15. L'expression des protéines peuvent être dosées 2-8 jours après la transfection. Cependant, l'expression de nombreuses protéines soutenue a été observée pendant des mois.

REMARQUE: Toutes les procédures animales étaient approuvés par le Comité du chancelier UCLA Animal Research comme prescrit par la Loi sur la protection des animaux et de la politique du PHS sur les soins aux animaux et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Les résultats représentatifs:

La mise en œuvre correcte de l'électroporation in vivo dans les procédures décrites ci-dessus devrait se traduire par la transfection de plasmides efficaces dans les muscles FDB et IO. Toutefois, l'efficacité de l'expression des variants de la protéine transgénique dépendra du plasmide, la taille et la complexité de la protéine, les propriétés fonctionnelles de la protéine, et un certain nombre d'autres variables hors de notre contrôle. Comme l'illustre la figure 1 pour un muscle FDB électroporation dans la présence d'un plasmide commercial (PMR-mCherry) codant pour la protéine mCherry, la plupart des fibres musculaires sont transfectées avec notre protocole, comme illustré par le fait que la plupart d'entre eux d'affichage à fluorescence rouge. Cela n'exclut pas la possibilité que les fibres individuelles présentent différents degrés d'expression de protéines, ou que quelques fibres ne sont pas du tout transfectées 3. Il doit be fait remarquer que l'expression efficace de grandes quantités de protéines fluorescentes comme mCherry, EGFP, ECFP et EYFP, n'altère pas l'excitabilité des fibres musculaires et propriétés de couplage excitation-contraction. En fait, ils sont indiscernables de ceux des muscles simulacre transfectées (résultats non présentés).

Approches pratiques utilisées pour vérifier l'expression des protéines localisées fluorescence marqués dans les fibres musculaires squelettiques.

La localisation intracellulaire des protéines exprimées di novo transgénique est évaluée régulièrement par l'acquisition simultanée, en utilisant le TPLSM, images fluorescentes des balises respectives et des images de marqueurs bien identifié des structures cellulaires. Le plus typique de ces derniers sont: a) la génération de second harmonique (SHG) des images, qui proviennent de l'anisotropie de la myosine sarcomériques Un bandes (centré à la M-lignes) 9,10, et b) di-8-ANEPPS de fluorescence images, qui peuvent être obtenues par marquage de la surface et transversale tubulaire (T-tubules) système de membranes des fibres musculaires avec cette dye11 imperméants potentiométrique. Dans les images de fluorescence des fibres musculaires colorés avec di-8-ANEPPS, le T-tubules apparaissent comme des bandes étroites de la fluorescence orienté approximativement orthogonale à l'axe longitudinal de la fibre. Ces bandes sont inégalement espacées les unes des autres: ils sont séparés par une longue distance qui s'étend à travers le M-lignes, et une courte qui s'étend à travers la ligne Z ^11.

Expression et localisation des α-actinine-EGFP dans les fibres musculaires squelettiques.

Un exemple de l'expression d'une variante de la protéine marqués musculaires structurelles α-actinine est montré dans la figure 2. Cette protéine est connue pour être une composante majeure de la ligne Z et, en tant que telle, est couramment utilisé comme marqueur de cette structure12. Nous transfectées muscles FDB et IO avec le plasmide pEGFPN1-α-actinin1 d'encodage pour l'homme (non musculaire) α-actinine marqués au terminal C avec EGFP. Six jours après la transfection, nous avons constaté que, tel qu'évalué par la fluorescence EGFP distribution, α-actinine est surtout exprimée à bandes étroites régulièrement espacés le long de l'axe de la fibre. Une seule bande par sarcomère est considéré (Figures 2A et 2D). La colocalisation de ces bandes avec le Z-lignes est démontrée en comparant la distribution de l'EGFP par fluorescence avec le SHG (figure 2B) et di-8-ANEPPS (figure 2E) des images. Comme le montre l'image de superposition (figure 2C), α-actinine-EGFP bandes alternées avec des bandes de SHG, ce qui indique qu'ils sont situés à mi-chemin entre deux consécutifs M-bandes, coïncidant avec l'emplacement de Z-lignes. Dans les fibres musculaires transfectées colorés avec di-8-ANEPPS, α-actinine-EGFP bandes sont vu centré entre chaque paire de tubules T (figure 2F) qui sont connus pour le flanc de la Z-lignes (c'est à dire séparées par une distance plus courte), indiquant ainsi que transgénique α-actinine est ciblée sur les Z-line.

Expression de DHPRα1s marqués à l'extrémité N-terminale avec EGFP

L'efficacité de la transfection du muscle avec pEGFPC1.1-DHPR 1s α est vérifiée dans les images TPLSM (figure 3A comme) montrant que la plupart des fibres d'exprimer EGFP-DHPRα1s (une protéine transmembranaire). La caractéristique la plus importante de fibres transfectées est le modèle double-bandes de la EGFP par fluorescence (figures 3A et 3B) comme on s'y attendrait si cette protéine a été ciblée sur les T-tubules. Il peut également être observé dans la figure 3 que tout l'affichage des différentes fibres différents niveaux d'intensité de fluorescence, le modèle de fluorescence bandes d'une fibre individuelle semble être maintenue homogène le long de la fibre. Au plus fort grossissement (figure 3B), il peut être clairement vu que l'espacement inégal entre les bandes est similaire à celle observée dans les fibres tachées di-8-ANEPPS (Figure 2E, par exemple). Les images de superposition (figure 3B & 3E) illustrent le fait que les bandes SHG sont situés dans le plus grand espacement entre EGFP-DHPRα1s bandes, corroborant que cette protéine est à la T-tubules. D'autres mesures de FRET avec l'anion non fluorescents lipophiles DPA (données non présentées) démontrent en outre que la fraction EGFP est au sein de quelques nanomètres de le feuillet interne des membranes des tubules T '.

La localisation et l'évaluation fonctionnelle de l'expression de EYFP-ClC1

Fibres transfectées avec pEYFP-ClC1, qui code pour une construction EYFP-marqués (à l'extrémité N-terminale) du canal chlorure de muscle squelettique (ClC1), affichage des bandes de fluorescence EYFP (figure 4A) avec une tendance similaire à celle observée pour l'EGFP-DHPRα1s 'expression (figure 3A) et correspondant à l'arrangement T-tubules comme illustré avec coloration di-8-ANEPPS (figure 2E). Comme prévu, la superposition de EYFP-ClC1 (figure 4A) et les images SHG (figure 4B) comme indiqué dans la superposition (figure 4C), illustrent le fait que les bandes SHG sont centrés à l'espacement des grandes of entre les bandes de fluorescence EYFP.

Afin d'évaluer si l'expression de EYFP-ClC1 traduit par une augmentation significative de la conductance de repos des fibres musculaires, comme prévu par la surexpression de canaux chlorure fonctionnel, nous fibres musculaires dissociées enzymatiquement à partir du muscle FDB transfectées et étudié leurs propriétés électrophysiologiques utilisant un microélectrodes deux montage expérimental décrit précédemment ^6,11,13. La figure 5 montre les résultats de deux fibres: une exprimant de grandes quantités de EYFP-ClC1 tel qu'évalué par des mesures globales d'intensité de fluorescence dans un microscope standard à fluorescence (non représenté), et l'autre est un contrôle non transfectées. Le record de tension dans la figure 5A (obtenu à partir de la fibre musculaire exprimer EYFP-ClC1) démontre qu'en raison de la conductance excessive de repos, la fibre est presque non-excitables. Impulsions de relance actuels jusqu'à 400nA (0.5ms) nécessaires pour être utilisé afin d'obtenir une réponse très faible activité (pas de figure 5A dépassement,). Après le remplacement de la solution de Tyrode externe à un contenant 500 uM de l'inhibiteur des canaux chlorure de 9-ACA, 200 impulsions nA actuelles étaient suffisantes pour susciter un potentiel d'action (figure 5B), mais beaucoup plus lent et plus larges que celles enregistrées dans la fibre de contrôle ( La figure 5C). Comme prévu, plus de 9-ACA a eu des effets minimes sur cette fibre de contrôle (figure 5D).

Figure 1. Efficacité de transfection de la méthode d'électroporation in vivo. Brightfield (A) et de fluorescence (B) des images d'un muscle FDB transfectées avec PMR-mCherry. Jours après le protocole d'électroporation: 12 jours. S'il vous plaît cliquez ici pour une version agrandie de la figure 1.

Figure 2. Expression et le ciblage des α-actinine-EGFP dans les fibres de FDB. Panels A et B sont de fluorescence EGFP et images SHG, respectivement, d'une fibre exprimer α-actinine-EGFP. Panel C est une superposition des images de A et B. Les panneaux D et E sont des images de fluorescence d'une autre fibre exprimer α-actinine-EGFP et colorées avec di-8-ANEPPS, respectivement. Panneau de F est la superposition d'images dans D et E. Jours après l'électroporation protocole: 6 jours.

Figure 3. Expression et le ciblage de l'EGFP-DHPRα1s en fibres FDB. Groupe A, l'EGFP image de fluorescence d'un groupe de fibres exprimant l'EGFP-DHPRα1s. Groupe B est un agrandissement de la place dans le panneau A, afin de mieux montrer le modèle bandes de l'expression des protéines. Panel C est l'image SHG correspondant à l'image dans le panneau A. D Panel est la superposition des images A et C. Groupe E est un élargissement de la zone indiquée dans Jours D. panneau après le protocole d'électroporation: 20 jours.

Figure 4. Expression et le ciblage des EYFP-ClC1 en fibres FDB. Les panneaux A et B sont de fluorescence EYFP et images SHG, respectivement, de fibres exprimant EYFP-ClC1. Panel C est la superposition des images dans les panneaux A et B. Groupe D est un profil d'intensité mesurée le long de la ligne blanche en surbrillance dans l'image dans Jours C. panneau après le protocole d'électroporation: 7 jours.

Figure 5. Fibres évaluation électrophysiologique exprimer transgéniques EYFP-ClC1. Panels A et B sont des enregistrements de tension d'une fibre exprimer EYFP-ClC1 en réponse à des impulsions de courant, avant et après traitement avec 9-ACA, respectivement. Panneaux C et D sont des enregistrements de tension (potentiel d'action) a suscité en réponse à des impulsions de courant dans une fibre non transfectées avant et après traitement avec 9-ACA, respectivement.

Discussion

Nous décrivons ici les étapes détaillées qui doivent être suivies afin d'atteindre transfections efficace de plasmides ADN dans les fibres musculaires squelettiques par électroporation in vivo. Les principaux avantages de notre approche sont la simplicité de mise en œuvre et son caractère invasif minimal qui en résulte risque négligeable pour la santé des animaux. En réalité, les protocoles ci-dessus décrite électroporation n'entraînent pas beaucoup plus que les injections sous-cutanées deux par pied, suivie par un protocole de stimulation électrique, qui sont tous bien toléré par les animaux sous anesthésie. Dans notre institution ces manipulations sont tout à fait déterminé à être non-chirurgicales, car ils ne comportent pas d'ouverture de la peau. Par ailleurs, la douceur des procédures électroporation est un facteur critique pour le succès global à atteindre une efficacité de transfection de plasmides et l'expression des protéines ultérieure par les fibres musculaires, depuis tout dommage cellulaire significative nuirait à leur capacité à s'engager efficacement dans la synthèse des protéines actives.

Des ajustements mineurs aux procédures décrites ici peuvent être (et ont été) mis en œuvre pour les grands muscles du pied de la souris (par exemple l'extenseur des orteils, EDL, jambier antérieur, TA, et les muscles soléaire). Par ailleurs, en tout l'intensification de la quantité totale d'ADN, nous avons mis en place les procédures exactes décrites ici pour transfecter les muscles FDB et IO de rats adultes avec un grand succès.

Bien que les protocoles de transfection systématiquement aboutir à un niveau variable de l'expression des protéines transgéniques par les fibres musculaires, ce qui peut être mis à profit dans des expériences physiologiques, la non-expression de fibres peuvent être utilisés comme témoins, et les fibres avec différents niveaux d'expression peuvent être utilisés pour corréler le niveau d'expression avec le niveau de changement de fonction. Aussi, les promoteurs CMV ont été trouvés pour être adaptée au rendement des niveaux élevés d'expression de protéines, d'autres muscles promoteurs spécifiques peuvent améliorer l'efficacité de l'expression des protéines. Il faut noter que quand il n'est pas possible (ou pratique) pour exprimer la protéine fluorescente construit-marqués dans les fibres musculaires, nous avons réussi à exprimer des protéines non marquées et de surveiller le niveau d'expression avec des plasmides bicistronique qui, simultanément, codent pour une protéine fluorescente.