Summary
우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.
Abstract
세포 생물학에 관심이 점점 자신의 내생적인 분포와 기능 관련을 조사하기 위해 필수적인 단백질 (예 : 찬란 태그를 구성 및 / 또는 돌연변이 변종)의 transgenically 수정된 형태를 표현하는 것입니다. 완전히 차별화된 세포에서이 목표를 성취하기 위해 구현되었습니다 흥미로운 접근 방식입니다
Protocol
FDB 및 IO 근육의 생체내 electroporation에 대한 실험 절차
- . 생체내의 electroporation 프로토콜의를 시작하기 전에, 포유류의 표현 plasmids는 2-5 μg TE의 μl / 플라스미드 참고 범위의 농도를 얻을 수로 증폭해야합니다 우리는 정기적으로 상업 증폭 키트를 사용하여 제조 업체 '절차를 따르십시오. 생체내 transfections의 골격근에서 매우 잘 CMV 프로 모터의 작동 실은 상업 표현 plasmids.
- 나누어지는 필요한 플라스미드 솔루션의 볼륨 (10-20 μl)와 두 0.5 ML Eppendorf 튜브 (마우스의 각 발에 하나씩)에 저장합니다.
- 무균 Tyrode 2 MG / ML hyaluronidase를 포함하는 솔루션을 준비합니다.
- anesthetizing 상자를 사용하여, 깊이 승인 가스 마취 기계와 O2의 isoflurane 4 % 사용하여 마우스를 마취. 손난로 (37 ° C)에서 동물을 놓고 쥐 얼굴 마스크를 사용하여 마취를 유지합니다. 발가락 핀치 반사하여 마취 심도를 모니터링합니다.
- 해부 현미경과 관찰에서 1 "길이 33 게이지 바늘을 사용하여 살균 마우스 한발의 footpads 아래 hyaluronidase 용액 10 μL를 주입. 발 뒤꿈치에 가까운 지점에서 피부에 침투하고 ~ 1 / 4 "에 대한 발가락의 기본 방향 subcutaneously 바늘을 전진.
- 원할 경우 다른 발과 절차를 반복합니다.
- 마취를 분리하고 새장에 마우스를 놓으십시오. 그것이 완전히 마취에서 회복하도록 허용합니다.
- 일시간 후, 두 번째 시간 동안 동물을 마취하고 가열 패드에 놓으십시오. hyaluronidase 솔루션을 설명하는 동일한 절차에 따라, 플라스미드 DNA (플라스미드 구조의 크기에 따라)의 20-50 μg의 총 주입. 총 주사 량이 적은 20 μL / 도보해야합니다. 주 : 15-20 μ의 L가 필요한 경우, 그것은 조직 접착제로 바늘 진입 점에서 피부를 닫습하는 것이 좋습니다.
- 마취를 분리하고 새장에 마우스를 놓으십시오. 그것이 완전히 마취에서 회복하고 10-15 분 기다리는 수 있습니다.
- 세 번째 시간의 동물을 마취하고 가열 패드에 놓으십시오.
- 동물의 한발을 선택합니다. 장소 하나는 금도금 침술의 발뒤꿈치에서 피부 밑에 바늘과 발가락의 바닥에 두 번째. 전극 기슭의 긴 축에 직각으로 서로 평행하고 지향하고 있습니다.
- 마이크로 클립 커넥터를 사용하여 전기 자극기에 바늘 (전극)의 머리를 연결합니다. 1Hz 20 펄스, 기간 / 각 20 MS를 적용하여 근육을 Electroporate. . 전극의 간격에 따라 펄스 '전압 진폭은 ~ 100 V / cm 참고 전기장 포기 (오실로 스코프로 모니터링하여) 조절 : 자극에 반응 없음 수축을 관찰해야하는 수준의 경우 마취가 적합합니다.
- 원할 경우, 동물의 contralateral 기슭에 위의 절차를 반복하십시오.
- 그 새장에 동물을 반환 한번 완전히 관찰하에 그것을 유지 마취에서 회복. 참고 : 프로 시저가 정상적으로된다면 동물이 30 분 이내에 완전한 이동성을 회복하고 나중 동식물 사육장의 동물 방으로 보낼 준비가됩니다. footpads에서 hyaluronidase와 DNA의 주사는 동물에 눈에 띄는 악영향이 없습니다. 일단 마취에서 회복 생쥐은 우리 주위에 정상적으로 앰버 수 있습니다. 추가 예방 차원에서, 0.0027 진통제로 2 일간 MG / ML에서 동물 Carprofen의 식수를 추가할 수 있습니다.
- 단백질 표정은 2-8일 transfection 후 assayed 수 있습니다. 그러나, 많은 단백질의 지속적인 표현은 몇 달 동안 관찰되었습니다.
참고 : 동물 복지 법률과 실험실 동물의 동물 애호 관리 및 사용에 PHS 정책에 의해 위임된으로 모든 동물의 절차는 UCLA 는구나 동물 연구위원회에 의해 승인되었습니다.
대표 결과 :
위에서 설명한 생체내의 electroporation 절차에의 올바른 구현은 FDB 및 IO 근육에 plasmids의 효과적인 transfection을 초래한다. 그러나, 유전자 변형 단백질 변종 표현의 효율성이 플라스미드에 따라 달라집니다, 단백질, 단백질의 기능 특성, 그리고 통제 밖의 다른 변수의 숫자의 크기와 복잡. mCherry 단백질에 대한 상업적인 플라스미드 (PMR - mCherry) 인코딩의 존재에 electroporated FDB 근육을 위해 그림 1에서 그림과 같이 그들의 대부분은 적색 형광을 표시 사실에 의해 그림과 같이, 근육 섬유의 대부분은 우리의 프로토콜 transfected 있습니다. 이것은 각각의 섬유는 단백질 표현의 다른 학위를 전시 가능성을 배제하지 않거나 일부 섬유는 모두 3 transfected되지 않습니다. 그것은 B해야전자는 mCherry, EGFP, ECFP 및 EYFP 같은 형광 단백질의 대량의 효율적인 표현이 근육 섬유 '흥분하고 여기 - 수축 결합 특성을 손상하지 않는 것을 지적했다. 사실, 그들은 가짜 transfected 근육 (결과가 표시되지 않음) 이들로부터 구별할 수 있습니다.
골격근 섬유의 찬란 - 태그 단백질의 언어 표현을 확인하는 데 사용되는 실용적인 접근.
디 노보 표현 유전자 변형 단백질의 세포내 지방화는 일상적으로 세포 구조를 잘 식별 마커의 각 태그 및 이미지의 TPLSM, 형광 이미지를 사용하여 인수 동시에 의해 평가됩니다. 이러한 후자의 가장 일반적인은 다음과 같습니다) 제 2 고조파 발생 (SHG) sarcomeric의 마이 오신 이방성 밴드 (M - 라인 중심) 9,10에서 발생하는 이미지, 그리고 B) DI - 8 - ANEPPS 형광 표면 및 가로 관을이 impermeant potentiometric dye11과 근육 섬유의 (T - 가느다란 관) 시스템 점막 라벨에 의해 얻을 수있다 이미지. DI - 8 - ANEPPS 물들일 근육 섬유의 형광 이미지에서 T - tubules는 섬유의 긴 축에 형광 지향 약 직교의 좁은 대역으로 나타납니다. 이 밴드는 unequally 서로 간격입니다 그들은 M - 라인에 걸쳐 걸쳐 장거리, 그리고 Z - 11 번 노선 전체에 걸쳐 짧은 하나에 의해 구분됩니다.
표현과 골격근 섬유의 α - actinin - EGFP의 지방화.
구조 근육 단백질의 태그 변종의 표현의 예제는 α - actinin은 그림 2에 표시됩니다. 이 단백질은 같은 정기적으로이 structure12의 표지로 사용, Z 라인의 주요 성분으로 알려진 것입니다. 우리는 α - actinin EGFP와 C 단자에 태그를 인간 (비 근육)에 대한 플라스미드 pEGFPN1 - α - actinin1 인코딩으로 FDB 및 IO 근육을 transfected. 엿새 transfection 후, 우리는 α - actinin은 대부분 동일 섬유 축을 따라 간격 좁은 밴드에서 표현 EGFP 형광 분포에 의해 평가, 것으로 나타났습니다. sarcomere 당 하나의 밴드는 (그림 2A & 2D) 볼 수 있습니다. Z - 라인이 밴드의 colocalization은 SHG (그림 2B)와 DI - 8 - ANEPPS (그림 2E) 이미지 EGFP 형광의 분포를 비교하여 입증됩니다. 마찬가지로 그들이 Z - 라인의 위치와 동시, 연속 2 M - 밴드 사이의 중간에 위치하는 표시, SHG 밴드 α - actinin - EGFP 밴드 대체 오버레이 이미지 (그림 2C)에 의해 표시됩니다. DI - 8 - ANEPPS 물들일 transfected 근육 섬유에서 α - actinin - EGFP 밴드는 측면에 Z - 라인 (즉, 짧은 거리로 구분) 알려진 T - tubules (그림 2 층)의 모든 쌍 사이의 중심으로 보는 따라서 형질 α - actinin은 Z - 라인을 타겟으로하는 것을 나타냅니다.
DHPRα1s 표현 EGFP와 N - 말단의 태그
pEGFPC1.1 - DHPR α 1S와 근육 transfection의 효율성은 그를 보여주는 TPLSM 이미지 (예 : 그림 3A)에서 확인할 수 있습니다 대부분의 섬유 표현 EGFP - DHPRα1s (transmembrane 단백질). transfected 섬유의 가장 두드러진 기능은 단백질이 T - tubules를 타겟으로하는 경우 예상했던대로 EGFP 형광 (그림 3A 및 3B)의 이중 줄무늬 패턴입니다. 또한 다른 섬유 형광 강도의 다양한 레벨을 표시하면서, 각 섬유의 줄무늬 형광 패턴이 섬유를 따라 균일 유지 것 같지만 그림 3에서 볼 수 있습니다. 높은 배율 (그림 3B)에서, 그것은 분명 밴드 간의 간격이 고르지 DI - 8 - ANEPPS (예 : 그림 2E) 스테인드 섬유에서 관찰하는 것과 비슷한 것을 볼 수 있습니다. 오버레이 이미지 (그림 3B & 3E) SHG 밴드이 단백질은 T - tubules에서입니다 corroborating, EGFP - DHPRα1s 밴드 사이의 큰 간격 내에 있는지 보여줍니다. 추가가 아닌 형광 lipophilic 음이온과 측정을 걱정 DPA - (데이터가 표시되지 않음) 더 EGFP의 잔기가 T - tubules '세포막의 내부 전단지의 몇 나노미터 이내입니다 보여줍니다.
현지화 및 EYFP - ClC1의 표현의 기능 평가
EGFP - DHPRα1s에 대한 관찰되는 비슷한 패턴으로 골격근 염화 채널 (ClC1), 디스플레이 EYFP 형광 밴드 (그림 4A)의 EYFP - 태그 구조를 (N - 터미널) 인코딩 pEYFP - ClC1와 transfected 섬유 '표현 (그림 3A)와 DI - 8 - ANEPPS의 얼룩 (그림 2E)로 그림과 같이 T - 가느다란 관 배치에 해당. 예상대로, EYFP - ClC1 (그림 4A)과 SHG 이미지 (그림 4B) 오버레이 (그림 4C)에서와 같이의 superimposition은 SHG 밴드가 넓은 간격 O 중심 있다고 설명EYFP 형광 밴드 사이에 F.
같은 기능 염화 채널의 overexpression 기대 근육 섬유의 휴식 전도성에 상당한 증가 EYFP - ClC1 결과의 표현, 우리 transfected FDB 근육의 효소 dissociated 근육 섬유들이 electrophysiological 속성을 공부 여부를 평가하기 위해 두 microelectrodes를 사용하여 실험 설정은 이전에 6,11,13 설명했다. 표준 형광 현미경의 글로벌 형광 강도 측정 (표시되지 않음)에서 평가로 EYFP - ClC1 대량의 표현 하나, 다른이 아닌 transfected 컨트롤입니다 : 그림 5는 두 섬유의 결과를 보여줍니다. 그림 5A에서 전압 레코드 (EYFP - ClC1을 표현 근육 섬유에서 얻은) 과도한 휴식 전도성으로 인해 그것을 보여줍니다, 섬유는 거의 비 고르기입니다. 최대 400nA (0.5ms)의 전류 자극 펄스는 매우 작은 적극적인 반응을 (노 오버 슈트, 그림 5A) 이끌어하기 위해 사용할 수 있도록했습니다. 염화물 채널 차단 9 ACA 500 μm의를 포함 한 외부 Tyrode 솔루션의 교체 후, 200 NA 전류 펄스 (즉, 제어 섬유에 기록보다하지만 훨씬 느린와 광범위한 실천 가능성 (그림 5B)를 이끌어내는하기에 충분했다 그림 5C). 예상대로, 9 - ACA의 또한이 컨트롤 섬유 (그림 5D)에 최소한의 영향을했다.
그림 1. 인 - 생체내 electroporation 방법의 Transfection 효율. 브라이트 (A) 및 형광 (B) FDB 근육의 이미지는 PMR - mCherry와 transfected. electroporation 프로토콜 후 일 : 12 일. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 위해.
그림 2. 표현과 FDB 섬유의 α - actinin - EGFP의 타겟팅. 패널 A와 B는 α - actinin - EGFP을 표현 섬유의 각각 EGFP의 형광 및 SHG 이미지,입니다. 패널 C는 A와 B. 패널 D와 E에있는 이미지의 중첩이다 각각 DI - 8 - ANEPPS과 α - actinin - EGFP와 스테인드을 표현하는 또 다른 섬유의 형광 이미지입니다. 육일 : 패널 F는 electroporation 프로토콜 후 D와 E 일 이내에 이미지의 중첩이다.
그림 3. 표현과 FDB 섬유에서 EGFP - DHPRα1s 타겟팅. 패널, EGFP - DHPRα1s을 표현 섬유 그룹의 EGFP 형광 이미지. 패널 B는 패널에서 사각형의 확대는 더 단백질 표현의 줄무늬 패턴을 보여주기 위해서. 패널 C는 패널 A. 패널 D의 이미지에 해당하는 SHG 이미지 것은 이미지의 오버레이는 A와 C. E가 패널 electroporation 프로토콜 후 패널 D. 날짜에 표시된 지역의 확대입니다 : 20 일.
그림 4. 표현과 FDB 섬유의 EYFP - ClC1 타겟팅. 패널은 A와 B는 EYFP - ClC1을 표현 섬유의 각각 EYFP의 형광 및 SHG 이미지,입니다. 칠일 : 패널 C는 A와 B. 패널 D가 electroporation 프로토콜 후 패널 C. 날짜에 이미지의 강조 하얀 선을 따라 측정된 강도 프로파일입니다 패널에있는 이미지의 중첩이다.
그림 5. 유전자 변형 EYFP - ClC1. 패널을 표현 Electrophysiological 평가 섬유 A와 B는 각각 9 ACA 치료 전후에 전류 펄스에 대한 응답으로 EYFP - ClC1을 표현 섬유의 전압을 기록하고 있습니다. 패널 C와 D가 아닌 transfected 섬유에 전류 펄스에 대한 응답으로 (행동 잠재력)가 elicited 전압 기록입니다 각각 9 - ACA와 치료 전후.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 여기서 생체내의 electroporation에 의해 골격 근육 섬유로의 DNA plasmids 효과 transfections을 달성하기 위해 따라야 할 자세한 단계를 설명합니다. 우리의 접근 방법의 주요 장점은 구현의 단순하고, 동물 무시할 건강 위험의 결과는 최소한의 invasiveness 있습니다. 현실에서는, 위에서 설명한 electroporation 프로토콜은 마취에서 동물에 의해 잘 용납하는 모든 중 전기 자극 프로토콜에 의해 뒤에 걸어서 당 두 피하 주사보다 더 많은 것들을 수반하지 않습니다. 저희 기관에서 이러한 조작은 모두 그들은 피부의 열기를 포함하지 않기 때문에 비 수술 절차로 결정됩니다. 게다가, electroporation 절차의 온후은 중요한 세포 손상이 효율적으로 활성 단백질 합성에 관여하는 능력에 악영향을 줄 것입니다 때문에 근육 섬유에 의해 효율적인 플라스미드 transfection 및 후속 단백질 표정을 취득에있는 전반적인 성공을위한 중요한 요소입니다.
여기에서 설명한 절차에 사소한 조정 될 수 있습니다 (그리고있다) 마우스 풋 (예 : 신근 digitorum longus, 편집 판단리스트, 정강뼈 앞쪽에, TA 및, soleus 근육)의 큰 근육을위한 구현. 또한, 단지 DNA의 총량을 확장하여, 우리는 큰 성공 성인 쥐의 FDB 및 IO 근육을 transfect하기 위해서는 여기서 설명하는 정확한 절차를 구현했습니다.
비 표현 섬유 컨트롤로 사용할 수 있으며, 표현의 다양한 수준의 섬유는 상호 연관하는 데 사용할 수있는, transfection 프로토콜은 지속적으로 근육 섬유에 의해 유전자 변형 단백질의 표현의 변수 수준의 결과이지만, 이것은 생리 실험에 이용 당 수 있습니다 기능 변화의 수준과 표현의 수준. 또한 CMV의 발기인은 단백질 표현의 높은 수준의 다른 근육 특정 발기인은 단백질 표현의 효능을 향상시킬 수 있습니다 항복에 적합한 것으로 판명되었습니다. 그것은 그것이 가능하지 않을 때 (또는 편리) 근육 섬유의 찬란 - 태그 단백질 구조를 표현하는 것을인지해야합니다, 우리는 태그가 지정되지 않은 단백질을 표현하는 성공과 동시에 형광 단백질을 인코딩 bicistronic의 plasmids과 표현의 수준을 모니터합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
우리는 우리와 함께 TPLSM 시설을 공유 박사 T. 오티스, 신경 생물학, UCLA의 부, 감사, 박사 C. pEYFP - ClC1 플라스미드의 종류 기증 Fahlke, 생리학 연구소, RWTH 아헨, 독일, 그리고 미스터 기술 지원. R. 세라노. 이 작품은 NIH / NIAMS 부여 AR047664과 AR54816의 보조금에 의해 지원되었다.
References
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).
- DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system. Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).
- Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons. Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle. Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).
- DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).
- Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy. J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres. Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).
- DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS. J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).
- Mills, M. Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).
