Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

Summary

Biz elektroporasyon ve floresan mikroskobu kullanarak protein ekspresyonu sonraki görselleştirme kullanılarak canlı farelerin ayak kaslarının lifleri plazmid DNA verimli transfeksiyon ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.

Abstract

Hücre biyolojisi büyüyen bir ilgi endojen dağılımı ve fonksiyonel önemi araştırmak için gerekli proteinler (örneğin floresan etiketli yapıları ve / veya mutant türevleri) transgenically değiştirilmiş biçimlerini ifade etmek. Ilginç bir yaklaşım tamamen farklılaşmış hücrelerin bu amacı yerine getirmek için uygulamaya konmuştur.

Protocol

FDB ve IO kasları in vivo elektroporasyon Deneysel Prosedürler

1. In vivo elektroporasyon protokolleri başlamadan önce, memeli ifade plazmid konsantrasyonu 2-5 mg / ul TE plazmid Not aralığında verim amplifiye olmalıdır: Biz rutin olarak ticari amplifikasyon kitleri kullanın ve üreticinin prosedürleri takip . In vivo transfections iskelet kası çok iyi CMV organizatörü çalışma taşıyan Ticari ifade plazmid.
2. Kısım plazmid çözüm gerekli hacmi (10-20 ul) ve iki adet 0.5 ml Eppendorf tüpleri (fare her bir ayak için bir tane) kaydedin.
3. Steril Tyrode 2 mg / ml hiyalüronidaz içeren bir solüsyon hazırlayın.
4. Bir anestezi kutusunu kullanarak, derin bir fare kullanarak onaylı bir gaz anestezi makinası ile O2% 4 izofluran anestezisi. Bir ısıtma yastığı (37 ° C) hayvan koyun ve bir kemirgen yüz maskesi kullanılarak anestezi korumak. Ayak tutam refleks ile anestezi derinliği izleyin.
5. Diseksiyon mikroskobu ile gözlem altında 1 "uzun 33 göstergesi steril bir iğne kullanarak fare tek ayak ayak pedleri, 10 mcL altında hiyalüronidaz çözüm enjekte edilir. Ayağın topuk yakın bir noktada cilde nüfuz etmesini ve deri altına iğne ~ 1 / 4 "için ayak tabanına doğru ilerlemek.
6. İstenirse diğer ayak ile aynı işlemi tekrarlayın.
7. Anestezi çıkarın ve fareyi bir kafes yerleştirin. Tam anestezi kurtarmak için izin verin.
8. Bir saat sonra, ikinci kez hayvan uyutmak ve ısıtma yastığı koyun. Hiyalüronidaz çözüm için açıklanan aynı prosedürü izleyerek, plazmid DNA (plazmid yapının büyüklüğüne göre) toplam 20-50 mg enjekte edilir. Toplam enjeksiyon hacmi az 20 mcL / ayak olmalıdır Not: 15-20 μ L gerekli olduğunda, cilt, doku yapıştırıcı ile iğne giriş noktasında kapatmak için tavsiye edilir .
9. Anestezi çıkarın ve fareyi bir kafes yerleştirin. Tam anestezi kurtarmak için izin ver ve 10-15 dakika bekleyin.
10. Üçüncü kez hayvan anestezisi ve ısıtma yastığı koyun.
11. Hayvanın bir ayağı seçin. Koyun, altın kaplama akupunktur Topuk deri altında iğne ve ayak tabanında bir diğeri. Elektrotlar yönelik ayak uzun eksenine dik ve birbirlerine paralel.
12. Iğneler (elektrotlar), mikro-klip konnektörleri kullanarak elektrik stimülatörü başkanı bağlayın. 1Hz 20 bakliyat, süresi / her biri 20 ms uygulayarak kasları Electroporate. Elektrotların aralık bağlı olarak, darbeleri 'gerilim genliği (bir osiloskop ile izleme), ~ 100 V / cm Not elektrik alan verim ayarlanır: uyaranlara yanıt yok kasılmaları dikkat edilmelidir düzeyinin ise anestezi yeterli.
13. İsterseniz, hayvan kontralateral ayak yukarıdaki işlemleri tekrarlayın.
14. Kendi kafesine hayvan dönün ve bir kez tam olarak gözlem altında sürdürmek anestezi kurtarıldı. Not: prosedürün normal giderse, hayvan, 30 dakika içinde tam hareketlilik kazanması ve daha sonra vivaryum hayvan odasına geri gönderilmek üzere hazır. Ayak pedleri hiyalüronidaz ve DNA enjeksiyonları, hayvanlar üzerinde farkedilebilir olumsuz etkileri yoktur. Bir kez anestezi kurtarıldı, fareler normalde kafes etrafında eşkin edebiliyoruz. Ek bir önlem olarak, 0,0027 mg / ml analjezik olarak 2 gün süreyle hayvan Carprofen içme suyu ekleyin.
15. Protein ifade transfeksiyon 2-8 gün sonra test edilmelidir. Ancak, birçok proteinlerin sürekli ifade ay boyunca görülmüştür.

NOT: Hayvan Refahı Kanunu ve İnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım PHS Politikası tarafından zorunlu olarak tüm hayvan işlemleri UCLA Başbakanı Hayvancılık Araştırma Komitesi tarafından kabul edildi.

Temsilcisi Sonuçlar:

FDB ve IO kasları plazmid etkin transfeksiyon, yukarıda açıklanan in vivo elektroporasyon prosedürleri doğru bir şekilde uygulanması sonucu gerekir . Ancak, transgenik protein çeşidi ifade verimliliği plazmid bağlıdır, protein, protein, fonksiyonel özellikleri ve bizim kontrolümüzün dışındaki diğer değişkenler bir dizi boyutu ve karmaşıklığı. MCherry protein için ticari bir plazmid (PMR-mCherry) kodlama varlığı electroporated bir FDB kas için Şekil 1'de gösterildiği gibi, bunlardan en çok kırmızı floresan ekran gerçeği ile gösterildiği gibi, kas liflerinin çoğu bizim protokol ile transfekte . Bu bireysel lifleri farklı derecelerde protein ekspresyonu sergileyen olasılığını ekarte değildir, ya da birkaç lif her 3 transfekte değildir. B olmalıdıre mCherry, EGFP, ECFP ve EYFP gibi floresan proteinleri büyük miktarda verimli bir şekilde ifade, kas lifleri eksitabilite ve eksitasyon-kasılma kaplin özellikleri zarar etmediğini kaydetti. Aslında, onlar sahte transfekte kasları (sonuçlar gösterilmemiştir) olanlardan ayırt edilemez.

Iskelet kas lifleri floresan etiketli proteinlerin yerelleştirilmiş ifade doğrulamak için kullanılan pratik yaklaşımlar.

Di novo ifade edilen transgenik proteinlerin hücre içi yerelleştirme rutin hücresel yapılarının iyi tanımlanmış belirteçlerin ilgili etiketleri ve görüntülerin TPLSM, floresan görüntüleri kullanarak, aynı anda satın tarafından değerlendirilir . Bu son en tipik şunlardır: a) ikinci harmonik üretimi (SHG) sarkomerik miyozin anizotropi bir bant (M hatları merkezli) 9,10 ortaya çıkan görüntü, ve b) di-8-ANEPPS floresan görüntüleri, yüzey ve enine tübüler bu laktobionat potansiyometrik dye11 kas liflerinin (T-tübül) sistemi zarı etiketleme ile elde edilebilir. Di-8-ANEPPS ile boyandı kas liflerinin floresan görüntüler, T-tübüller uzun lif eksenine floresan odaklı yaklaşık dik dar bant olarak görünür. Bu bantlar eşitsiz birbirinden aralıklı: M-hatları üzerinden yayılan uzun bir mesafe ve ¹¹ Z-line üzerinden yayılan kısa bir bir ayrılır.

İfade ve iskelet kas lifleri α-aktinin-EGFP lokalizasyonu.

Α-aktinin, yapısal kas protein etiketli bir varyant ifade bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu protein gibi rutin olarak bu structure12 bir işaretleyici olarak kullanılan, Z-line önemli bir bileşeni olarak bilinen ve. Biz α-aktinin EGFP ile C terminalinde etiketli insan (non-kas) plazmid pEGFPN1-α-actinin1 kodlama FDB ve IO kasları transfekte. Transfeksiyon Altı gün sonra, α-aktinin çoğunlukla lif ekseni boyunca eşit aralıklı dar bantlar ifade EGFP floresan dağıtım, değerlendirilen bulundu. Sarkomer başına tek bir grup (Şekil 2A ve 2B) görülür. Z-hatları ile bu bantları ko EGFP floresan dağıtım SHG (Şekil 2B) ve di-8-ANEPPS (Şekil 2E) görüntüleri ile karşılaştırarak gösterilmiştir. Z-hatlarının konumu ile örtüşen, birbirini takip eden iki M-bantları arasında yarı yolda bulunan olduğunu belirterek, SHG bantları ile α-aktinin EGFP bantları alternatif kaplama görüntü (Şekil 2C) ile gösterilir. Di-8-ANEPPS ile boyanmış transfekte kas lifleri, α-aktinin-EGFP bantları, T-tübüller (Şekil 2F) kanadına Z hatları (yani kısa bir mesafe ile ayrılmış) bilinen her çifti arasında merkezli görülür böylece transgenik α-aktinin, Z-line hedef olduğunu göstermektedir.

DHPRα1s İfadesi EGFP N-terminalindeki etiketlenen

PEGFPC1.1-DHPR α 1s kas transfeksiyon etkinliği olduğunu gösteren TPLSM görüntü (örneğin Şekil 3A) doğrulandı en lifleri ifade EGFP DHPRα1s (transmembran protein). Transfekte lifleri en belirgin özelliği, bu proteinin T-tüplerdeki hedef ise bekleneceği üzere çift bantlı desen EGFP floresans (Şekil 3A ve 3B). Aynı zamanda farklı liflerin floresan çeşitli düzeylerde görüntüler, bantlı floresan desen bireysel bir lif lif boyunca homojen korunabilir görünüyor Şekil 3'te görülebilir. Yüksek büyütme (Şekil 3B), açıkça, düzensiz gruplar arasında boşluk di-8-ANEPPS (örneğin Şekil 2E) boyanmış lifleri gözlenen benzer olduğunu görülmektedir olabilir. Bindirme görüntüleri (Şekil 3B & 3E) SHG bantları, bu proteinin T-tübüller olduğunu doğrulayan EGFP-DHPRα1s bantları arasında büyük bir boşluk içinde yer olduğunu göstermektedir. Ek floresan olmayan lipofilik anyon ile ölçümler FRET DPA (veriler gösterilmemiştir) EGFP benzer parçaları daha T-tübüller 'membranların iç broşürün birkaç nanometre içinde olduğunu göstermek.

Yerelleştirme ve EYFP-ClC1 ifade fonksiyonel değerlendirme

EGFP-DHPRα1s gözlenen benzer bir yapı ile iskelet kas klorür kanal (ClC1), ekran EYFP floresan bantları (Şekil 4A) EYFP etiketli inşa (N-terminal) kodlar pEYFP ClC1 ile transfekte Elyaf 'ifade (Şekil 3A) ve di-8-ANEPPS boyama (Şekil 2E) ile gösterildiği gibi T-tübül düzenlemeye karşılık. Beklendiği gibi, üst üste EYFP-ClC1 (Şekil 4A) ve SHG görüntüleri (Şekil 4B) kaplama (Şekil 4C) 'de gösterildiği gibi, SHG büyük boşluklar o bantlar merkezli olduğunu göstermekEYFP floresan bantları arasında f.

EYFP ClC1 sonuçları fonksiyonel klorür kanalları aşırı ekspresyonu beklendiği gibi kas lifleri dinlenme iletkenlik önemli bir artış ifade transfekte FDB kas enzimatik ayrışmış kas lifleri ve elektrofizyolojik özellikleri okudu olmadığını değerlendirmek için deney düzeneği daha önce bir iki Mikroelektronlar ^kullanarak 6,11,13 tarif . Biri, standart bir floresan mikroskop küresel floresan yoğunluğu ölçümleri (gösterilmemiştir) değerlendirilen EYFP-ClC1 büyük miktarlarda ifade ve diğer olmayan bir transfekte kontrolü: Şekil 5 iki liflerinden sonuçları gösterir. Şekil 5A gerilim kayıt (EYFP ClC1 ifade kas lifi elde) aşırı dinlenme iletkenlik nedeniyle gösterir, fiber neredeyse olmayan heyecanlı. Şu uyaran bakliyat kadar 400nA (0.5ms) çok küçük bir aktif yanıt (hiçbir aşmayı, Şekil 5A) ortaya çıkarmak için kullanılan gerekiyordu. Klorür kanal blokeri 9-ACA 500 mcM içeren bir dış Tyrode çözüm değiştirilmesi sonra, 200 nA akım darbeleri (, kontrol fiber kaydedilen dışında olmasına rağmen çok daha yavaş ve daha geniş bir aksiyon potansiyeli (Şekil 5B) ortaya çıkarmak için yeterli Şekil 5C). Beklendiği gibi, bu kontrol fiber (Şekil 5D) 9-ACA Ayrıca minimal etkisi vardı.

Şekil 1 in vivo elektroporasyon yöntemi Transfeksiyon verimliliği aydınlık (A) ve floresans (B) bir FDB kas görüntüleri PMR-mCherry transfekte. Elektroporasyon protokol gün sonra 12 gün. Lütfen buraya tıklayın Şekil 1'de bir büyük versiyonu için.

Şekil 2 İfade ve FDB lifleri α-aktinin-EGFP hedef Panelleri A ve B sırasıyla α-aktinin-EGFP ifade eden bir lif EGFP floresan ve SHG görüntüleri,. Panel C, A ve B. Paneller D ve E görüntüleri süperpozisyon, sırasıyla, di-8-ANEPPS ile α-aktinin-EGFP ve lekeli ifade başka bir lif floresan görüntüler. 6 gün: Panel F elektroporasyon protokolü sonra D ve E. günlük görüntüler süperpozisyon.

Şekil 3 İfade ve FDB lifleri EGFP-DHPRα1s hedef. Panel, EGFP-DHPRα1s ifade liflerinin bir grup EGFP floresan görüntü. B Paneli kare bir genişleme panelinde bir protein ifade bantlı desen daha iyi göstermek için. Panel C SHG görüntü paneli A. Panel D görüntüye karşılık gelen görüntü bindirme A ve C. Panel E elektroporasyon protokolü sonra panele D. Gün gösterilen alanında bir genişleme: 20 gün.

Şekil 4 İfade ve FDB lifleri EYFP-ClC1 hedef. Paneller A ve B lifleri EYFP-ClC1 ifade sırasıyla EYFP floresan ve SHG görüntüler,. 7 gün: Panel C, A ve B Paneli D elektroporasyon protokolü sonra panele C. Gün görüntü vurgulanan beyaz çizgi boyunca ölçülen bir yoğunluk profili panelleri görüntülerin süperpozisyon.

Şekil 5 transgenik EYFP-ClC1 Panelleri ifade Elektrofizyolojik değerlendirme lifleri A ve B sırasıyla, 9-ACA ile tedavi öncesi ve sonrası akım darbeleri yanıt EYFP-ClC1 ifade fiber gerilim kayıtları. Panelleri C ve D olmayan bir transfekte fiber akım darbeleri karşısında aksiyon potansiyelleri ortaya çıkardı gerilim kayıtları sırasıyla 9-ACA ile tedavi öncesi ve sonrası.

Discussion

Biz burada, in vivo elektroporasyon iskelet kas lifleri DNA plazmid etkili transfections ulaşmak için takip edilmesi gereken ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır . Yaklaşımın ana avantajı, uygulama kolaylığı ve hayvanlar için önemsiz sağlık açısından tehlike sonuçları minimal invazivlik. Gerçekte, yukarıda açıklanan elektroporasyon protokolleri anestezi altında hayvanlar tarafından iyi tolere edilen tüm elektrik stimülasyonu protokolü tarafından takip ayak başına iki subkutan enjeksiyonlar, çok daha fazla arz etmezler. Kurumumuzda bu manipülasyonlar tamamen cilt açılması söz konusu olmadığından, cerrahi olmayan prosedürleri olarak belirlenmiştir. Bunun yanı sıra, elektroporasyon prosedürlerin yumuşaklıkları herhangi bir önemli hücre hasarına aktif protein sentezini yapmaya verimli yeteneklerini olumsuz çünkü kas lifleri etkin bir plazmid transfeksiyon ve sonraki protein ekspresyonu ulaşmada genel başarısı için kritik bir faktördür.

Burada açıklanan prosedürlere küçük ayarlamalar olabilir (ve) büyük kaslar için fare ayağı (örneğin ekstansör digitorum longus, EDL, anterior tibial, TA ve soleus kas) uygulanmaktadır. Ayrıca, DNA toplam miktarın sadece ölçeklendirme, biz büyük bir başarı ile yetişkin sıçanların FDB ve IO kasları transfect için burada açıklanan tam prosedürleri uygulamaya koymuştur.

Ifade lifleri kontrol olarak kullanılabilir ve lifleri farklı düzeyde ifade ile ilişkilendirmek için kullanılabilir; transfeksiyon protokolleri, sürekli bir değişken düzeyde kas lifleri tarafından transgenik proteinlerin ifade olmasına rağmen, bu fizyolojik deneylerde avantajı alınacak. fonksiyon değişikliği ile ifade seviyesi. Ayrıca, CMV rehberleri, verimli, yüksek düzeyde protein ekspresyonu, protein ekspresyonu diğer kas-özel rehberleri etkinliğini artırabilir uygun olduğu tespit edilmiştir. Bu mümkün değildir (veya uygun) kas lifleri floresan etiketli protein yapıları ifade etmek için dikkat edilmelidir, etiketsiz proteinleri ifade başarılı ve bicistronic aynı anda bir floresan proteini kodlayan plazmid ile ifade seviyesini ölçmek gerekir .