Summary
Endothelial kolonibildande progenitorceller (ECFCs) är ett lovande verktyg för att studera vaskulär homeostas och reparation.
Abstract
Denna uppsats presenterar en ny återhämtning strategi för endotelceller kolonibildande progenitorceller (ECFCs) från hepariniserat men annars unmanipulated vuxna humant perifert blod inom ett medelvärde på 12 dagar. Efter storskaliga utbyggnaden> 1x10 8 ECFCs kan erhållas för ytterligare tester. Fördel genom att använda pHPL kontakten av mänskliga celler med bovint serum antigener kan uteslutas. Med flödescytometri och immunhistokemi de isolerade cellerna kan karakteriseras som ECFC och in vitro-funktionalitet för att bilda blodkärl liknande strukturer som kan testas i ett matrigel analys. Ytterligare dessa celler kan subkutant injicerat i en musmodell för att bilda funktionella, perfusion fartyg in vivo. Efter långsiktiga expansion och frysförvaring spridning, funktion och genomisk stabilitet verkar vara bevaras. 3,4
Detta djur-protein utan isolering och expansion metod är lätt att tillämpa för att generera en stor mängd ECFCs.
Protocol
A.) ECFC ISOLATON
DAG 1:
- Innan du börjar med experimentet förbereda cellkulturmedium Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). Tillägg 500ml Endothelial bassubstratets-2 med heparin (1 ml 1000 E / ml), 5ml 100x lösning av penicillin / streptomycin (alla Sigma, St Louis, MO, www.sigmaaldrich.com ), L-glutamin (2 mM slutlig koncentration ), och 50 ml poolade humana trombocyter lysat (pHPL). Tillsätt därefter 0,2 ml hydrokortison, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml VEGF, 0,5 ml fonden, 0,5 ml IGF-1 och 0,5 ml askorbinsyra (tillhandahålls som SingleQuots, alla Lonza, Walkersville, MD, http://www.lonzabioscience. se / ). Sterila filtratet mediet via en 0,2 m-porstorlek 500 ml Millipore vakuumfilter. Sedan pHPL bildar små blodproppar kan du behöva två filter för ett medium. Pre-varm filtreras EGM-2 till 37 ° C i ett vattenbad
- Samla blodprov genom att 5 ml vuxna humant perifert blod från kubiska venen i en 6 ml utan konserveringsmedel natrium-heparin blod Vacutainer rör. Du bör behandla blodprov inom högst två timmar.
- Börja med att förbereda en 75 cm 2 (T75, Costar) kolv med ventilerat lock, en 25 ml pipett och två 5 ml pipetter i ett laminärt flöde bänk.
- Pre-fill 15 ml förvärmda kompletteras EGM-2 i kolven med 25 ml pipett. Nu öppnar blodet flaskan och prova alla 5 ml med 5 ml-pipetten ner i kolven. Skölj tomma blodet injektionsflaska med 5 ml av extra stämman-2 med den andra 5 ml pipett. Den totala volymen inom T75 är 25 ml. Stäng ventilerade cap i kolven och placera i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2 och 95% luftfuktighet under 24 timmar.
DAG 2:
- Efter cirka 24 timmar (över natten) bör du ta bort medellång blodet blandningen att bli av med icke vidhäftande celler. För detta förbereder två 25 ml pipetter och tre 5 ml pipetter i laminärt flöde, förvärma 20 ml kompletteras EGM-2 (förberett dagen innan) och 30 ml PBS till 37 ° C i ett vattenbad.
- Ta kolven med provet från kuvösen och ta bort alla supernatanten med en 25 ml pipett. Se till att inte repa kolven ytan för att undvika att skada eventuella koloni. Tvätta inre kolven cellen följsamhet yta tre gånger genom att försiktigt lägga till 10 ml förvärms PBS och luta kolven från ena sidan till den andra. Ta bort PBS omedelbart varje gång och kasta.
- Tillsätt 20 ml färsk förvärmda EGM-2 till kolven och placera den tillbaka in i inkubatorn. Denna process bör göras så snabbt och skonsamt som möjligt för den bifogade cellerna inte att lossa. ECFCs lossnar lätt om de hålls i PBS eller i rumstemperatur för länge.
- Skärmen genom kolven systemiskt varannan dag med början på dag två med en låg förstoring av ett ljusmikroskop söker ECFC utväxt. När en koloni finns märket på toppen på den yttre sidan av kolven att ange position för kolonin. Observera att flaks inte bör utanför inkubator för mer än 5 minuter.
DAG 5:
- På den femte dagen efter sådd genomföra en fullständig medelstora förändring att ta bort icke-häftande celler. För detta ändamål förvärma 20 ml av EGM-2 till 37 ° C i ett vattenbad och förbereda två 25 ml pipetter.
- Ta bort hela mediet med hjälp av en 25 ml pipett och tillsätt färsk, förvärmda kompletteras EGM-2 så snart som möjligt. Celler bör inte lämnas utan medel för mer än en minut för att undvika uttorkning. Sätt tillbaka in i inkubatorn och upprepa screening kolven dagligen.
- Mata cellerna genom att ersätta 30% av de medelstora med färska kompletteras EGM-2 gånger i veckan.
DAG 14-28:
- Typiska kolonier med kullersten morfologi ska visas runt dag 12. Markera den övre yttre sidan av kolven för att ange positionen för varje koloni. Låt kolonierna att växa fram till dag 28 om inte enstaka celler börjar att lossa. En gång har det primära kolonier identifieras de kan skördas mellan dag 14 och 28, beroende på storlek.
B.) ECFC HARVEST
- Förvärma 5 ml trypsin 0,05% / EDTA, 20 ml PBS och 5ml färska kompletteras EGM-2.
- Helt ta bort mediet från kolven till en Falcon rör (se till att inte röra vid ytan på kolven till att undvika att skada eventuella koloni) och tvätta cellerna försiktigt med 10 ml förvärmd PBS.
- Tillsätt 5 ml trypsin / EDTA och inkubera i 5 minuter i inkubatorn. Cellerna bör inte utsättas för trypsin i mer än 7 minuter eftersom det blir giftiga. Grundligt knacka på sidorna av kolven hjälper cellerna att lossa. Släck aktivitet trypsin proteas genom att tillsätta ca 10 ml används bevarade odlingsmedium.
- Ta bort cellsuspension i en 50 ml Falcon rör. Tvätta kolven en gång med 10 ml PBS som därefter läggs till den skördade cellsuspension. Centrifugera cellsuspension på 300 g under 7 min vid 4 ° C för att samla in cellerna och ta bort trypsin. Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten omedelbart i 1 ml PBS. Håll på is.
- Bestäm mobilnummer som beskrivs i en JUPITER protokoll av R. Ricardo och K. Phelani 5.
C.) ECFC EXPANSION
- Tillägg 500 ml EGM-2 som beskrivs i A 1,1). Förvärma till 37 ° C i ett vattenbad.
- För cirka 2500 cm 2 kulturen utrymme förbereda ett antingen 11 T220 (225 cm 2) eller 15 T175 (175 cm 2) eller en fyra lager cellfabriken (CF-4, Nunc, Aurora, IL, http://www.nuncbrand . com ). Dessutom behöver du två färska vent-kepsar och en speciell steril tratt i laminärt flöde bänken.
- Till utsäde ECFCs på en start celltäthet av 100 C / cm 2 Beräkning av cellen numret är nödvändig. För ett CF-4 252.800 celler är suspenderade i 500 ml färsk EGM-2 och hälls i CF-4 med hjälp av den sterila tratt. Nära ett utlopp med ventil-cap och luta CF-4 till en longitud sidan, vilket möjliggör en jämn fördelning av mediet mellan alla 4 mjöl. Sedan luta kammaren tillbaka och öppna locket på ventilen cap. Placera CF-4 i kuvös.
- Förändring 20% av de medel minst en gång varje vecka tills CF-4 är konfluenta.
- Harvest celler som beskrivs i B) genom att använda 70 ml trypsin / EDTA och ca 200 ml PBS.
Representativa resultat
Med denna isolering metod som vi observerade en primär koloni bildas vid dag 12. I en tidigare studie kunde återvinna ett medelvärde på 4,0 ± 0,8 ECFC-kolonier från varje ml av perifert blod. 4 ECFCs visade en typisk kullersten utseende. Efter storskalig expansion, med en seedning densitet på 100 celler / cm 2, fick vi> 1 x 10 8 celler i totalt ca 30 dagar från 3 hanar och 1 tik frivilliga (ålder mellan 26 och 50 år).
ECFC odlade under dessa förhållanden visade sig vara proliferativ, funktionella och genomiskt stabil. 4 Dessutom cellerna kan lagras (i 10% DMSO) i flytande kväve för vidare användning. 3,4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna nya isolering och expansion metod är en enkel och effektiv process som är mer effektiv och mindre tidskrävande genom att undvika någon cell separation (ingen densitetsgradient behövs) och billigare än konventionella tekniker. Genom att använda pHPL kontakt med nötkreatur antigener och möjliga efterföljande xenoimmunization är utesluten. Under kultur perioden små blodproppar kan bildas, som orsakas av pHPL. Baserat på våra erfarenheter av dessa blodproppar påverkar inte koloni bildning och celltillväxt eller funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr Katharina Schallmoser för att ge pHPL och Margaretha Frühwirth och Daniela Thaler för utmärkt tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | |
| preservative-free Heparin | Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 2mM per EGM-2 | |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma-Aldrich | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
|
| Trypsin/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
|
| PBS | |||
| Four-layered cell factory (CF-4) | Corning | ||
| Sterile Funnel | Corning | ||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | ||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) | BD Biosciences | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
|
| 50ml Falcon tubes | Falcon BD | ||
| 5ml Stripetts | Costar | ||
| 25ml Stripetts | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| 0,2 pore size sterile filter | EMD Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
