Summary
De analytische ultracentrifuge (AUC) monster cel houdt monster en referentie-buffer en tijdens de experimenten en wordt blootgesteld aan een hoog vacuüm en rotor met snelheden tot 60.000 tpm. Deze video zal aantonen aan de strenge aandacht voor detail nodig is voor de montage, laden en afstemming van deze zeer belangrijke component van een AUC experiment.
Abstract
De analytische ultracentrifuge (AUC) is een krachtig hulpmiddel biofysische dat ons toelaat om macromoleculaire sedimentatie profielen opnemen tijdens hoge snelheid centrifugeren. Wanneer behoorlijk gepland en uitgevoerd, een AUC sedimentatie snelheid of sedimentatie evenwicht experiment kan veel onthullen over een eiwit met betrekking tot grootte en vorm, sample zuiverheid, sedimentatie coëfficiënt, oligomerization staten en eiwit-eiwit interacties.
Deze techniek vereist echter een rigoureuze niveau van technische aandacht. Meetoplossing het bezit van een in sectoren centrum stuk ingeklemd tussen twee venster assemblages. Ze worden afgesloten met een koppel druk van circa 120 tot 140 in / lbs. Referentie-buffer en het monster worden geladen in het middelpunt sectoren en vervolgens na verzegeling, de cellen zijn precies uitgelijnd in een titanium rotor, zodat de optische detectie systemen zowel monster en referentie-buffer in dezelfde radiale weg middellijn te scannen via elke kern sector tijdens het roteren met een snelheid tot 60, 000 rpm en onder zeer hoog vacuüm
Niet alleen is een goede sample cel montage kritisch, monster cel componenten zijn erg duur en moet goed worden verzorgd, zodat ze in optimale conditie te werken, om lekken en breken te voorkomen tijdens de experimenten. Ga voorzichtig om met windows, want zelfs de geringste barsten of krassen kan leiden tot een breuk in de centrifuge. Het contact tussen de centrale en ramen moeten zo strak mogelijk, dat wil zeggen geen Newton s ringen moeten zichtbaar zijn na het moment druk wordt uitgeoefend. Stof, pluisjes, krassen en oliën op zowel de ramen of het middelpunt elk compromis dit contact en kan heel gemakkelijk leiden tot het lekken van oplossingen van de ene sector naar de andere of uitlekken van de kern samen. Niet alleen zijn waardevolle samples verloren, het lekken van oplossingen tijdens een experiment zal een onbalans van de druk in de cel die vaak leidt tot kapotte ramen en centerpieces veroorzaken. Bovendien moet plug pakkingen en huisvesting stekkers stevig te zijn om oplossingen die worden getrokken uit het middelpunt sector door middel van het laden gaten door de hoge vacuüm in de centrifuge kamer te vermijden. Raam liners en pakkingen moeten vrij zijn van breuken en scheuren die ervoor kunnen zorgen beweging resulteert in gebroken ruiten.
Deze video zal onze procedures van het monster cel montage te tonen, koppel, laad-en rotor aanpassing aan een minimum te beperken component schade, oplossing lekken en breuk tijdens de perfecte AUC experiment.
Protocol
Sample Cel Montage en Torque
- We beginnen monster cel bouw door het samenstellen van twee raam assemblages.
Plaats een raam pakking in het venster houder. Plaats het venster liner (of is het soms wel een venster kussen) in het venster houder, zodat de opening van de liner is tegenover de spiebaan van de houder. Bij een lichte hoek, plaats het venster in de houder aanpassing van de schrijver markering op het raam met de sleutel weg van het venster houder. Druk zachtjes op zijn randen aan beide zijden van het paneel. - Om een goede afdichting en nauwkeurige koppel van het monster cel te garanderen, hebben we lichtjes jas de behuizing pakking en de schroef ring met Spinkote smeermiddel. Spreid een zeer kleine hoeveelheid van Spinkote tussen je duim en wijsvinger. Smeer de schroef ring onderwerpen die met een dunne, onzichtbare film van Spinkote. Ook de vacht van de behuizing pakking. Veeg zichtbare smeermiddel.
- Begin monster cel montage door met een venster montage, met het venster naar boven naar u toe, in de cel behuizing door het afstemmen van de spiebaan met de behuizing te drukken. Lijn het middelpunt spiebaan met de behuizing, en laat het zachtjes vallen op de top van het venster de montage in de cel.
- Gebruik nooit een soort van hulpmiddel om de kern duw in de cel behuizing. Dit kan leiden tot permanente schade aan het CP resulteert in lekken tijdens de experimenten. Draai het tweede venster assemblage, zodat het raam is gericht naar het middelpunt, van u af, spiebaan af te stemmen met behuizing toets en schuif het naar beneden op de top van het middelpunt. Plaats een behuizing pakking op de bovenkant, dan een schroef ring, zodat het woord "Out" zichtbaar is. Met behulp van uw vingers en een uitlijningslaser, draai de schroef ring.
Als de CP niet gemakkelijk in de behuizing vat de eerste af te stemmen, dan plaatst u het tweede venster montage bovenop. Door het toepassen van lichte neerwaartse druk op het raam montage, schuift zowel in de cel huis op hetzelfde moment. Op deze manier vermijden we drukken direct op de CP.
Nu is een goed moment om te kijken in de cel voor stof, pluizen en vingerafdrukken. U zal ook merken Newton Ringen te geven dat er nog lucht tussen de CP en de ramen. Deze zullen verdwijnen na het aanbrengen van het koppel. - Met de schroef ring omhoog en het woord "out" zichtbaar is, plaats het monster cel helemaal naar beneden in de cel koppel spantang van het koppel stand. Houd de cel in plaats door het toepassen van een constante druk op het koppel stand te verwerken. In een vloeiende beweging, draai de schroef ring tussen 120-140 in-lbs. Bij gebruik van een verstelbare micrometer momentsleutel, zet deze dan tussen 120-140 in / pond en draai de schroef ring totdat wrench "klikt" met vermelding van het ingestelde draaimoment is bereikt. Laat het koppel staan handvat en voorzichtig het monster cel te verwijderen zonder het aanraken van de ramen.
Laden en afdichten van de Sample Cell
- Voor sedimentatie snelheid experimenten hebben we regelmatig last een volume van 400ul in elke sector van de 12mm middenstuk met behulp van een 200ul pipet. Plaats het monster cel met het laden gaatjes aan de bovenkant en het woord "out" op de schroef ring zichtbaar. Schuif de pipetpunt half naar beneden in de linker centrale sector door middel van de laad-gaten en langzaam afzien 200ul van de referentie-oplossing. Herhaal dit een keer te 400ul totaal. Met dezelfde pipetpunt en dezelfde techniek, voorzichtig en langzaam te vullen op de RIGHT middelpunt sector 400ul van de monsteroplossing.
De volumes van 150 tot 180 ul worden gebruikt voor sedimentatie evenwicht experimenten, maar dezelfde zorg en de techniek moet worden gevolgd.
Het is noodzakelijk om de volumes van de referentie-en sample-oplossingen zo dicht mogelijk te maken. Montage van de pipetpunt stevig op de pipet, langzaam laden en dispensers, het vermijden van het laden van bubbels en met dezelfde pipet tip voor beide oplossingen alle hulp in het houden van de volumes gelijk mogelijk te maken. - Seal de cel door het plaatsen van twee nieuwe rode behuizing plug pakkingen stevig in elkaar laad-gat ervoor te zorgen dat ze worden gepositioneerd tussen het centrum stuk en de aluminium behuizing. Bedek elk met een behuizing stekker. Draai met een kleine platte schroevendraaier.
Voorbeeld Celuitlijning in Rotor
- Voor het laden van de rotor, zorg ervoor dat het tegenwicht is niet meer dan 0,5 g lichter dan het monster cel in de tegengestelde positie in het geval dat monster cel lekken. Begin met het saldo op nul. De eerste wegen van het monster cel die zal zijn in de positie tegenover het CB. Tarra het saldo aan het monster cel gewicht af te trekken, dan wegen de CB. Optellen of aftrekken gewicht van de aanhechting gat van de tegenwicht. Zorg ervoor dat gewicht niet uitsteken van de top. Weeg om ervoor te zorgen dat het tegenwicht uiteindelijke gewicht binnen 0,5 g lichter dan het tegenovergestelde monster cel.
- Met behulp van een 4-plaats rotor, het tegenwicht dus plaats in positie 4, dat de witte pijl zichtbaar is, en wijst in thij de richting van de middelpuntvliedende kracht. Zorg ervoor dat het naar beneden helemaal in de rotor. Voorzichtig draai de stelschroef, gevonden op de top van het tegenwicht aan de overkant van de witte pijl, totdat het tegenwicht wordt stevig op zijn plaats, maar nog steeds kunnen worden uitgelijnd. Plaats de evenwichtige monster cel met de behuizing stekkers tegenover het midden van de rotor en het woord "out" op de schroef ring zichtbaar.
- Zoek van onder de rotor, lijnt de binnenkant schrijver teken (het merk dichtst bij het centrum van de rotor) met de schrijver markering op het tegenwicht met behulp van een alignment tool. Draai de stelschroef aan uitgelijnd tegenwicht te vergrendelen. Op dezelfde manier, lijnt de steekproef cel afgetekende lijn met de binnenkant afgetekende lijn op positie 2 op de rotor.
Voor meer informatie zie https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
De juiste cel montage, monster inbrengen, en cel aanpassing in de rotor is van cruciaal belang voor een hoge kwaliteit AUC experimenten. Dit geldt, in het bijzonder voor experimenten die een zeer gedetailleerde analyse van de verkregen gegevens op de macromoleculaire sedimentatie profielen vereisen, bijvoorbeeld bij het bestuderen van eiwit interacties en het bepalen van sporen totaalbedragen. Vaak is de kwaliteit van de experimentele opstelling is beperkt voor de juistheid en de precisie van de resultaten van de AUC studie. Voor meer informatie over de praktische ontwerp en de verdere uitvoering van de AUC experimenten, zie Referenties 1 - 3. Workshops over de praktische opzet, theorie en data-analyse van de AUC experimenten worden twee keer per jaar op ons laboratorium aan de National Institutes of Health [4].
Acknowledgments
Wij erkennen het onderzoek te ondersteunen door de intramurale Research Program van NIBIB, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
