Summary
Ultracentrifuge אנליטית (AUC) תא מדגם מחזיקה מדגם חיץ התייחסות במהלך ניסויים חשוף ואקום גבוה ומהירויות הרוטור עד 60,000 סל"ד. וידאו זה יהיה להדגים את תשומת לב קפדנית לכל פרט הכרחי עבור טעינת הרכבה, ויישור של מרכיב זה חשוב מאוד של ניסוי AUC.
Abstract
Ultracentrifuge אנליטית (AUC) הוא כלי biophysical עוצמה המאפשר לנו להקליט שקיעה פרופילים macromolecular במהלך צנטריפוגה במהירות גבוהה. כאשר מתוכנן כהלכה והוצאו להורג, מהירות שקיעה AUC או שיווי משקל הניסוי שקיעה יכולה לגלות הרבה על חלבון לגבי גודל וצורה, טוהר המדגם, מקדם שקיעה, מדינות oligomerization ו חלבונים אינטראקציות.
טכניקה זו, לעומת זאת, דורש רמה של תשומת לב קפדנית טכנית. תאים לדוגמא להחזיק פיסת מרכז sectored דחוקה בין שתי אסיפות החלון. הם חתומים עם לחץ של מומנט סביב 120-140 ב / ק"ג. מאגר יעץ מדגם נטענים לתוך המגזרים המרכזי ואז לאחר איטום, התאים מיושרים במדויק לתוך הרוטור טיטניום כך מערכות זיהוי אופטי לסרוק הן מדגם חיץ התייחסות לקו האמצע באותו מסלול הרדיאלי דרך כל מגזר המרכזי בעוד סיבוב במהירויות של עד 000 סל"ד 60, תחת ואקום גבוה מאוד
לא רק מדגם נאות תא הרכבה קריטי, התא רכיבים מדגם יקרים מאוד ויש יטופלו כהלכה כדי לוודא שהם במצב עבודה אופטימלי על מנת למנוע דליפות שבירה במהלך הניסויים. ידית חלונות בקפידה, אפילו את הסדק הקל ביותר או לגרד יכולה להוביל שבירה בצנטריפוגה. הקשר בין מרכזי וחלונות חייב להיות חזק ככל האפשר, כלומר לא טבעות ניוטון זה צריך להיות גלוי לאחר הלחץ מוחל מומנט. , מוך אבק, שריטות או שמנים על החלונות או המרכזי לכל פשרה זה קשר והוא יכול בקלות רבה לגרום דליפה של פתרונות מתחום אחד למשנהו או דולף מתוך המרכזי הכל ביחד. לא רק דגימות יקרות לאיבוד, דליפה של פתרונות במהלך ניסוי יגרום לחוסר איזון של לחץ בתא מובילה לעיתים קרובות חלונות וסידורי שבור. בנוסף, אטמים התקע המתחבר הדיור חייב להיות בבטחה במקום כדי למנוע פתרונות להיות שלף של המגזר המרכזי דרך החורים העמסה על ידי ואקום גבוה בתא צנטריפוגות. ספינות חלון אטמים חייב להיות ללא הפסקות וסדקים שעלולים לגרום לתנועה וכתוצאה מכך חלונות שבורים.
סרט הווידאו הזה תדגים נהלי שלנו הרכבה תא מדגם, מומנט העמסה יישור הרוטור על מנת למזער את הנזק רכיב, פתרון דולף ושבירה במהלך הניסוי AUC מושלמת.
Protocol
נייד מדגם העצרת מומנט
- אנחנו מתחילים תא בנייה מדגם ידי לשים יחד 2 אסיפות החלון.
הנח אטם חלון לתוך המחזק את החלון. מקם את אניה חלון (או שזה נקרא לפעמים כרית החלון) בתוך מחזיק את החלון כך הפתיחה של אניה היא מול חור המנעול של בעל. בזווית קלה, במקום חלון בעל יישור סימן סופר על החלון עם הדרך מפתח של בעל החלון. לחץ כלפי מטה בעדינות בקצוות מאוד משני צידי החלון. - כדי להבטיח אטימה ראויה מומנט מדויק של התא מדגם, אנו קלות המעיל אטם הדיור ואת טבעת בורג עם סיכה Spinkote. מורחים כמות קטנה מאוד של Spinkote בין האגודל לאצבע המורה. מעיל את הטבעת הנושאים בורג עם סרט דק בלתי נראה של Spinkote. כמו כן, המעיל אטם דיור. תמחקי את כל חומר סיכה לעין.
- בגין תא הרכבה מדגם ידי הזזה חלון אחד של העצרת, עם חלון הפונה כלפי מעלה, אל לך, לתוך התא דיור על ידי יישור חור המנעול עם המפתח דיור. יישר את חור המנעול עם המפתח המרכזי דיור ולתת לו ליפול בעדינות על גבי הרכבה חלון בתוך התא.
- אין להשתמש בכל סוג של כלי לדחוף את מרכזי דיור לתוך התא. הדבר עלול לגרום נזק בלתי הפיך למחסום וכתוצאה מכך דליפה במהלך הניסויים. סובבו את הרכבה החלון השני, כך החלון פונה לכיוון המרכזי, הרחק ממך, ליישר חור המנעול עם המפתח דיור והחלק אותו כלפי מטה על גבי במרכז. הנח אטם דיור על גבי, אם כן, טבעת בורג כל כך את המילה "Out" גלוי. בעזרת האצבעות כלי היישור, יד להדק את טבעת בורג.
אם המפלגה הקומוניסטית לא להחליק בקלות לתוך החבית דיור, קודם ליישר אותה, אם כן, מקום ההרכבה החלון השני על גבי זה. על ידי הפעלת לחץ כלפי מטה בעדינות על הרכבה חלון, להחליק לתוך שתי דיור התא בעת ובעונה אחת. בדרך זו, אנו נמנעים לחיצה ישירות על המפלגה הקומוניסטית.
עכשיו הוא זמן טוב להסתכל בתוך התא עבור מוך אבק, טביעות אצבעות. תוכלו גם להבחין טבעות ניוטון המעידים יש עדיין אוויר בין CP והחלונות. אלו ייעלמו לאחר החלת מומנט. - עם הטבעת לפשל והמילה "החוצה" גלוי, במקום תא מדגם כל הדרך למטה בתוך collet התא מומנט של דוכן מומנט. החזק תא במקום על ידי הפעלת לחץ קבוע על ידית מומנט לעמוד. בתנועה רציפה אחת, להדק את טבעת בורג אל בין 120-140 ב-ק"ג. אם באמצעות מפתח ברגים מתכוונן מומנט מיקרומטר, להגדיר את זה בין 120-140 ב / ק"ג ולהדק את טבעת בורג עד מפתח "קליקים" המציין את מומנט להגדיר הושג. שחרר את ידית מומנט לעמוד ובזהירות להסיר את תא מדגם בלי לגעת בחלונות.
טעינה איטום תא Sample
- על הניסויים מהירות שקיעה, אנו שגרתי עומס נפח 400ul לתוך סקטור אחד מרכזי 12mm בעזרת פיפטה 200ul. מקם את התא מדגם עם החורים העמסה על גבי והמילה "החוצה" על הטבעת בורג גלוי. החלק את חצי הדרך פיפטה קצה לתוך המגזר המרכזי שמאלה דרך החורים העמסה לאט לוותר 200ul של פתרון התייחסות. חזור פעם אחת בסך הכל 400ul. משתמש קצה פיפטה אותו באותה טכניקה, בזהירות ולאט לאט למלא את הסקטור המרכזי ימינה עם 400ul של פתרון המדגם.
כרכים של ul 150-180 משמשים לניסויים שיווי משקל שקיעה אבל את הטיפול באותה טכניקה ויש אחריו.
זה הכרחי כדי להתאים את כמויות של פתרונות התייחסות מדגם ככל האפשר. התאמת קצה פיפטה בחוזקה על פיפטה, לאט העמסה מחלק פתרונות, הימנעות בועות טעינה באמצעות קצה פיפטה זהה בשני פתרונות כל סיוע בשמירה על כרכים כמו שווה ככל האפשר. - חותם התא על ידי הנחת 2 חדש אדום תקע אטמים דיור בנוחות לתוך כל חור הטעינה לוודא שהם ממוקמים בין היצירה מרכז הדיור אלומיניום. מכסים כל אחד עם תקע דיור. יד להדק עם מברג שטוח ראש קטן.
נייד מדגם המערך ב רוטור
- לפני טעינת הרוטור, ודא לאזן הוא לא יותר מ 0.5 גרם קל יותר מאשר בתא מדגם במצב ההפוך במקרה זה תא דליפות המדגם. התחל עם יתרת אפס. ראשית לשקול את התא מדגם זה יהיה בעמדה מול CB. טרה את האיזון כדי להפחית את משקל התא המדגם, אם כן, לשקול את CB. להוסיף או לגרוע משקל מהחור מצורף של משקל נגד. ודא משקולות לא לבלוט מלמעלה. Reweigh כדי להבטיח את המשקל הסופי הוא לאזן בתוך 0.5 גרם קל יותר מאשר תא המדגם השני.
- באמצעות הרוטור 4-מקום, במקום לאזן לעמדה 4, כך על החץ הלבן גלוי מצביע tהוא הכיוון של כוח צנטריפוגלי. ודא זה כל הדרך למטה בתוך הרוטור. להדק בעדינות את הבורג להגדיר, נמצא על גבי לאזן את ממש מול החץ הלבן, עד לאזן את זה במקומו, אך עדיין מסוגל להיות מתואם. מקם את התא מדגם מאוזנת עם הדיור תקעים מול מרכז הרוטור ואת המילה "החוצה" על הטבעת בורג גלוי.
- במבט מלמטה הרוטור, ליישר את סימן בתוך הסופר (סימן הקרוב במרכז הרוטור) עם סימן הסופר על לאזן באמצעות כלי היישור. הדקו את הבורג להגדיר לנעול לאזן מיושר במקום. באותו אופן, ליישר את התא מדגם סופר לסמן עם הסימן בתוך הסופר בעמדה 2 על הרוטור.
לקבלת מידע נוסף ראה https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
הרכבה תא ראויה, הכניסה המדגם, ויישור תא הרוטור הוא קריטי עבור ניסויים באיכות גבוהה AUC. הדבר נכון במיוחד, עבור ניסויים הדורשים ניתוח מפורט מאוד של נתונים על רכש את הפרופילים שקיעה macromolecular, למשל, כאשר לומדים אינטראקציות חלבון וקביעת מצטבר בכמויות זעירות. לעתים קרובות את האיכות של ההתקנה הניסיונית היא המגביל את הדיוק ואת הדיוק של תוצאות המחקר AUC. לפרטים על תכנון וביצוע מעשי נוספת של ניסויים AUC, ראה הפניות 1-3. סדנאות המכסה את ההתקנה תיאוריה מעשית, וניתוח נתונים של ניסויים AUC מתקיימות פעמיים בשנה במעבדה שלנו במכון הלאומי לבריאות [4].
Acknowledgments
אנו מכירים את התמיכה מחקר על ידי תוכנית המחקר עירונית של NIBIB, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
