Summary
Il ultracentrifuga analitica (AUC) delle cellule del campione tiene campione e tampone di riferimento e durante gli esperimenti, ed è esposto a alto vuoto e velocità del rotore fino a 60.000 giri al minuto. Questo video dimostra l'attenzione rigorosa ai dettagli necessari per l'assemblaggio, il caricamento e l'allineamento di questa componente molto importante di un esperimento AUC.
Abstract
Il ultracentrifuga analitica (AUC) è un potente strumento biofisico che ci permette di registrare profili sedimentazione macromolecolare durante la centrifugazione ad alta velocità. Se correttamente progettato ed eseguito, una velocità di sedimentazione AUC o esperimento equilibrio di sedimentazione in grado di rivelare una grande quantità di una proteina in quanto a dimensioni e la forma, la purezza del campione, coefficiente di sedimentazione, afferma oligomerizzazione e interazioni proteina-proteina.
Questa tecnica, tuttavia, richiede un livello di attenzione rigorosa tecnica. Celle campione possesso di un pezzo sectored centro a sandwich tra due assemblee finestra. Essi sono sigillati con una pressione di coppia di circa 120-140 in / lbs. Tampone e del campione vengono caricati nei settori centrale e poi, dopo di tenuta, le cellule sono perfettamente allineati in un rotore in titanio in modo che i sistemi di rilevamento ottico di scansione sia di esempio e di buffer di riferimento sulla linea mediana stesso percorso radiale attraverso ogni settore centrale durante la rotazione a velocità fino a 60, 000 giri al minuto e sotto vuoto molto alto
Non solo è corretto montaggio cella campione critici, i componenti delle cellule del campione sono molto costosi e devono essere adeguatamente curato per garantire che siano in ottimali condizioni di lavoro al fine di evitare perdite e rotture durante gli esperimenti. Maneggiare con cura le finestre, perché anche la minima crepa o graffio può portare alla rottura nella centrifuga. Il contatto tra il centro e le finestre devono essere il più stretto possibile, cioè gli anelli di Newton non s dovrebbe essere visibile dopo che la pressione viene applicata una coppia. Polvere, lanugine, graffi e oli su entrambi i finestrini o il fulcro ogni compromesso questo contatto e può facilmente portare a perdite di soluzioni da un settore all'altro o fuoriuscire il centro tutti insieme. Non solo i campioni preziosi persi, perdite di soluzioni durante un esperimento causerà uno squilibrio di pressione nella cella che spesso porta a vetri rotti e centrotavola. Inoltre, guarnizioni spina e prese alloggio deve essere saldamente in atto per evitare soluzioni di essere tirato fuori dal settore centrale attraverso i fori di carico dal vuoto spinto nella camera di centrifuga. Rivestimenti finestra e le guarnizioni devono essere privi di rotture e crepe che potrebbero causare il movimento con conseguente rottura dei vetri.
Questo video dimostra le nostre procedure di assemblaggio campione di cellule, di coppia, il caricamento e l'allineamento del rotore per ridurre al minimo i danni ai componenti, la soluzione di perdite e rotture durante l'esperimento perfetto AUC.
Protocol
Esempio di assemblaggio delle celle e di coppia
- Iniziamo la costruzione delle cellule del campione, mettendo insieme due assemblee finestra.
Inserire una guarnizione finestra nel supporto finestra. Posizionare il rivestimento finestra (o è talvolta chiamato un cuscino finestra) dentro il titolare finestra in modo che l'apertura del rivestimento è di fronte alla cava del titolare. Con una leggera angolazione, posizionare la finestra nel supporto allineando la tracciatura della finestra con il modo in chiave del titolare finestra. Premere delicatamente ai bordi molto su entrambi i lati della finestra. - Per garantire la chiusura e la coppia accurata della cella campione, abbiamo coprire leggermente la guarnizione corpo e l'anello a vite con lubrificante Spinkote. Stendere una piccola quantità di Spinkote tra il pollice e l'indice. Rivestire le filettature anello con una sottile pellicola invisibile di Spinkote. Allo stesso modo, cappotto la guarnizione alloggi. Eliminare ogni lubrificante visibile.
- Iniziare il montaggio delle cellule campione facendo scorrere uno di assemblaggio finestra, con la finestra rivolta verso l'alto verso di voi, nella custodia del cellulare allineando la linguetta con la chiave di casa. Allineare la scanalatura centrale con la chiave di casa e lasciarlo cadere delicatamente sulla parte superiore della finestra di montaggio all'interno della cellula.
- Non usare mai alcun tipo di strumento per spingere il fulcro nella sede della cella. Ciò potrebbe causare danni permanenti al CP con conseguente perdita durante gli esperimenti. Girare la seconda assemblea finestra in modo che la finestra è rivolta verso il centro, lontano da voi, allineare cava con chiave alloggi e farlo scorrere verso il basso sulla parte superiore del centro. Inserire una guarnizione alloggiamento sulla parte superiore, poi, un anello a vite in modo che il "Out" è visibile. Usando le dita e uno strumento di allineamento, la mano stringere l'anello di vite.
Se il CP non scivola facilmente nel barile abitazioni, prima allineare, poi, luogo la seconda assemblea finestra su di esso. Applicando leggera pressione al ribasso sul gruppo finestra, far scorrere entrambi nella custodia del cellulare allo stesso tempo. In questo modo, evitiamo premendo direttamente sul PC.
Ora è un buon momento per guardare all'interno della cellula per la polvere, lanugine e impronte digitali. Noterete anche Newton Anelli che indicano che c'è ancora aria tra il CP e le finestre. Questi scompaiono dopo l'applicazione della coppia. - Con l'anello a vite e la parola "fuori" visibile, mettere la cella del campione fino in fondo nella pinza cellula coppia dello stand di coppia. Tenere in luogo delle cellule, applicando una pressione costante sul manico supporto della coppia. In un movimento continuo, stringere l'anello di vite tra i 120-140 in-lbs. Se si utilizza una chiave dinamometrica regolabile micrometrico, è impostato tra i 120-140 in / lbs e stringere la ghiera fino a chiave "click" che indica la coppia impostata è stata raggiunta. Rilasciare la maniglia stare coppia e rimuovere con attenzione la cellula campione senza toccare le finestre.
Carico e di tenuta della cella campione
- Per gli esperimenti velocità di sedimentazione, abbiamo regolarmente caricare un volume di 400ul in ogni settore del centrotavola 12 millimetri con una pipetta 200ul. Posizionare la cella campione con i fori di carico in alto e il "fuori" parola sull'anello viti a vista. Far scorrere il modo puntale metà giù verso il settore centro sinistra attraverso i fori di carico e lentamente erogare 200ul di soluzione di riferimento. Ripetere una volta al totale 400ul. Utilizzando la punta della pipetta stessa e la stessa tecnica, con cura e lentamente riempire il settore DESTRA centrotavola con 400ul di soluzione campione.
I volumi di 150-180 ul vengono utilizzati per esperimenti di equilibrio di sedimentazione, ma la stessa cura e la tecnica devono essere seguite.
E 'indispensabile per soddisfare i volumi di soluzioni e del campione il più possibile. Montaggio la punta della pipetta saldamente la pipetta, lentamente carico e di erogazione di soluzioni, evitando le bolle di carico e usando la punta della pipetta stessa per entrambe le soluzioni di tutti gli aiuti a mantenere i volumi uguali possibile. - Sigillare il cellulare mettendo 2 nuovi rosso guarnizioni custodia connettore comodamente in ogni foro di carico assicurandosi che siano posizionati tra il pezzo centrale e l'alloggiamento in alluminio. Coprire ciascuno con un tappo contenitore. Serrare a mano con un piccolo cacciavite a testa piatta.
Esempio di allineamento in cella rotore
- Prima di caricare il rotore, assicurarsi che il contrappeso non è più di 0,5 g più leggere rispetto alla cella campione nella posizione opposta nel caso in cui le perdite delle cellule del campione. Iniziate con il saldo a zero. Prima pesare la cella campione che sarà in posizione di fronte al CB. Tarare la bilancia per sottrarre il peso delle cellule del campione, poi, pesa il CB. Aggiungere o sottrarre il peso del foro di fissaggio del contrappeso. Assicurarsi che i pesi non sporgono dalla parte superiore. Pesare per garantire che il peso finale è a controbilanciare 0,5 g più leggere rispetto alla cella campione opposto.
- Utilizzando un 4-luogo rotore, posizionare il contrappeso in posizione 4, in modo che la freccia bianca è visibile e che vanno in tha la direzione della forza centrifuga. Assicurarsi che sia fino in fondo all'interno del rotore. Delicatamente la vite di fissaggio, che si trova sulla parte superiore del contrappeso proprio di fronte alla freccia bianca, fino a quando il contrappeso è saldamente in posizione, ma ancora in grado di essere allineati. Posizionare la cella campione equilibrato con il corpo tappi di fronte al centro del rotore e il "fuori" parola sull'anello viti a vista.
- Guardando da sotto il rotore, allineare la presente all'interno scriba (il marchio più vicino al centro del rotore) con la tracciatura sul contrappeso utilizzando uno strumento di allineamento. Stringere la vite per bloccare controbilanciare allineati in posizione. Allo stesso modo, allineare la cellula campione scriba marchio con il marchio all'interno scriba in posizione 2 sul rotore.
Per ulteriori informazioni, vedere https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
L'assemblea cellula corretta, l'inserimento del campione e l'allineamento delle cellule nel rotore è fondamentale per gli esperimenti di alta qualità AUC. Questo è vero, in particolare, per esperimenti che richiedono un'analisi molto dettagliata dei dati acquisiti su profili sedimentazione del macromolecolari, per esempio, quando si studiano le interazioni delle proteine e determinare gli importi globali traccia. Spesso la qualità della configurazione sperimentale è limitante per l'accuratezza e la precisione dei risultati dello studio AUC. Per i dettagli sulla progettazione pratica e l'ulteriore esecuzione di esperimenti AUC, vedere Riferimenti 1 - 3. Workshop che copre la configurazione pratica, teoria e analisi dei dati di esperimenti AUC si terranno due volte l'anno presso il nostro laboratorio presso il National Institutes of Health [4].
Acknowledgments
Riconosciamo l'appoggio di ricerca dal Programma di Ricerca Intramurale NIBIB, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
