Summary
A ultracentrífuga analítica (AUC) célula de amostra detém amostra e tampão de referência e durante as experiências e é exposto a alto vácuo e velocidades de rotor até 60.000 rpm. Este vídeo vai demonstrar a atenção rigorosa ao pormenor necessário para o carregamento, montagem e alinhamento deste componente muito importante de um experimento AUC.
Abstract
A ultracentrífuga analítica (AUC) é uma ferramenta poderosa biofísicos que nos permite gravar perfis de sedimentação macromolecular durante a centrifugação de alta velocidade. Quando devidamente planejado e executado, uma velocidade de sedimentação AUC ou experiência de equilíbrio de sedimentação pode revelar muito sobre uma proteína em relação ao tamanho e forma, a pureza da amostra, coeficiente de sedimentação, afirma oligomerização e interações proteína-proteína.
Esta técnica, entretanto, requer um nível de atenção rigorosa técnica. Células da amostra segurar um pedaço centro sectored imprensado entre dois conjuntos janela. Eles são selados com uma pressão de torque de cerca de 120-140 in / lbs. Tampão de referência e amostra são carregados para os setores central e, em seguida, após a selagem, as células são precisamente alinhados em um rotor de titânio para que os sistemas de detecção óptica digitalizar ambos amostra e tampão de referência na linha média mesmo caminho radial através de cada setor central enquanto roda em velocidades de até 60, 000 rpm e sob vácuo muito alto
Não só é a montagem de células de amostra adequada crítica, componentes de célula de amostra são muito caros e devem ser devidamente tratados para garantir que eles estão em ótima condição de trabalho, a fim de evitar vazamentos e quebras durante as experiências. Lidar com janelas com cuidado, pois mesmo a menor rachadura ou arranhão pode levar à quebra na centrífuga. O contato entre central e janelas devem ser tão apertada quanto possível; anéis ou seja, sem Newton s deve ser visível após a pressão torque é aplicado. Poeira, fiapos arranhões e óleos sobre o Windows ou o centro todo compromisso esse contato e pode muito facilmente levar ao vazamento de soluções de um setor para outro ou vazamento para fora do centro todos juntos. Não são apenas amostras preciosas perdidas, vazamento de soluções durante um experimento irá causar um desequilíbrio de pressão na célula que muitas vezes leva a janelas quebradas e centerpieces. Além disso, juntas plug and plugs de habitação deve ser firmemente no lugar para evitar soluções que está sendo retirado do setor central através dos orifícios de carga pelo alto vácuo na câmara de centrifugação. Liners janela e juntas devem estar livres de quebras e rachaduras que poderiam causar o movimento, resultando em janelas quebradas.
Este vídeo vai demonstrar os nossos procedimentos de montagem de célula de amostra, a carga de torque e alinhamento do rotor para ajudar a minimizar danos aos componentes, a solução de vazamentos e quebras durante o experimento AUC perfeito.
Protocol
Assembléia amostra de células e Torque
- Começamos a construção de células de amostra reunindo duas assembléias janela.
Coloque uma junta janela para o titular janela. Posicione o forro janela (ou às vezes é chamado de uma almofada janela) dentro do porta-janela para que a abertura do forro fica em frente à chaveta do titular. Em um pequeno ângulo, coloque a janela no porta-alinhando a marca escriba na janela com o modo como chave do titular janela. Pressione suavemente nas bordas muito em ambos os lados da janela. - Para garantir a vedação adequada e torque precisa da célula de amostra, que leve casaco a junta do alojamento eo anel de rosca com lubrificante Spinkote. Espalhe uma quantidade muito pequena de Spinkote entre o polegar eo indicador. Revista as roscas anel parafuso com uma película fina e invisível de Spinkote. Da mesma forma casaco, a junta de habitação. Limpe qualquer lubrificante visível.
- Iniciar a montagem de célula de amostra, deslizando um conjunto de janela, com a janela voltada para cima em direção a você, na carcaça de célula, alinhando a ranhura com a chave da habitação. Alinhe a ranhura central com a chave da habitação e deixou-o suavemente cair em cima da janela de montagem dentro da célula.
- Nunca use qualquer tipo de ferramenta para empurrar a peça central na carcaça celular. Isso pode causar danos permanentes ao CP, resultando em fuga durante as experiências. Vire o conjunto segunda janela para que a janela está virada para o centro, longe de você, alinhar chaveta com chave de habitação e deslize-o em cima do centro. Coloque uma junta de habitação no topo, então, um anel de rosca para a palavra "Out" é visível. Usando seus dedos e uma ferramenta de alinhamento, mão apertar o anel do parafuso.
Se a CP não deslizar facilmente para o barril de habitação, primeiro alinhe-o, então, coloque o conjunto da segunda janela em cima dela. Ao aplicar uma pressão descendente suave na montagem janela, deslize ambos à habitação celular ao mesmo tempo. Desta forma, evitamos pressionando diretamente sobre a CP.
Agora é um bom momento para olhar para dentro da célula para o fiapo, poeira e impressões digitais. Você também vai notar Anéis de Newton que indicam que ainda há ar entre a CP e as janelas. Estes irão desaparecer após a aplicação de torque. - Com o anel e parafuso até a palavra "out" visíveis, coloque a célula de amostra todo o caminho dentro da pinça torque de células do stand torque. Segure no lugar de células através da aplicação de uma pressão constante sobre a alça ficar torque. Em um movimento contínuo, apertar o anel de rosca para entre 120-140 in-lbs. Se estiver usando uma chave de torque ajustável micrômetro, configurá-lo para entre 120-140 in / kg e apertar o anel chave de parafuso até "cliques" que indica o torque set foi atingido. Solte a alça de pé torque e remova cuidadosamente a célula de amostra, sem tocar no windows.
Carga e Vedação da célula de amostra
- Para experimentos velocidade de sedimentação, que rotineiramente carregar um volume de 400ul em cada setor da central 12 milímetros com uma pipeta de 200ul. Posição da célula de amostra com os orifícios de carga em cima ea palavra "out" no anel parafuso visível. Deslize a meio caminho da pipeta ponta para baixo para o setor central ESQUERDA através dos orifícios de carga e, lentamente, dispensar 200ul de solução de referência. Repetir uma vez ao total de 400ul. Usando a ponta da pipeta e mesmo a mesma técnica, cuidadosa e lentamente preencher o setor central DIREITO com 400ul de solução de amostra.
Volumes de 150-180 ul são usados para experimentos de equilíbrio de sedimentação, mas o mesmo cuidado e técnica devem ser seguidas.
É imperativo para combinar com os volumes de soluções de referência e amostra, tanto quanto possível. Montagem da ponta da pipeta firmemente na pipeta, lentamente carregamento e distribuição de soluções, evitando bolhas de carga e usando a ponta da pipeta mesma para ambas as soluções toda a ajuda na manutenção dos volumes tão iguais quanto possível. - Vedação da célula, colocando duas novas juntas plugue vermelho habitação confortavelmente em cada buraco carregamento ter certeza que eles estão posicionados entre a peça central ea carcaça de alumínio. Cubra cada um com um plugue de habitação. Aperte com uma chave de fenda pequena plana.
Alinhamento amostra de célula em Rotor
- Antes de carregar o rotor, certifique-se o contrapeso não é mais do que 0,5 g mais leve que a célula de amostra na posição oposta no caso de vazamentos de célula de amostra. Comece com o saldo a zero. Primeira pesar a célula de amostra que será em posição oposta ao CB. Tare a balança para subtrair o peso da amostra de células, então, pesar o CB. Adicionar ou subtrair o peso do furo de fixação do contrapeso. Certifique-se de pesos não se projetam a partir do topo. Pesar novamente para garantir que o contrapeso final é 0,5 g dentro mais leve que a célula de amostra oposto.
- Utilizando um rotor de 4 lugares, coloque o contrapeso para a posição 4 para que a seta branca é visível e apontando em tele direção da força centrífuga. Certifique-se que é todo o caminho dentro do rotor. Gentilmente apertar o parafuso de ajuste, encontrado no topo do contrapeso do outro lado da seta branca, até que o contrapeso está firmemente no lugar, mas ainda capaz de ser alinhado. Posição da célula de amostra equilibrada com a habitação plugs de frente para o centro do rotor e da palavra "out" no anel parafuso visível.
- Olhando de debaixo do rotor, alinhe a marca escriba dentro (a marca mais próxima do centro do rotor) com a marca de escriba na contrabalançar usando uma ferramenta de alinhamento. Aperte o parafuso de ajuste para bloquear contrabalançar alinhados no lugar. Da mesma forma, alinhar a amostra marca escriba celular com a marca dentro de escriba na posição 2 sobre o rotor.
Para mais informações, consulte https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
O conjunto de células adequada, a inserção da amostra, e alinhamento de células no rotor é fundamental para experimentos de alta qualidade AUC. Isso é verdade, em particular, para experimentos que requerem uma análise muito detalhada dos dados adquiridos nos perfis de sedimentação macromolecular, por exemplo, ao estudar as interações proteína e determinação montantes agregados de rastreio. Muitas vezes a qualidade da montagem experimental é limitante para a exatidão e precisão dos resultados do estudo AUC. Para detalhes sobre o design prático e posterior execução de experimentos AUC, ver Referências 1-3. Workshops cobre a configuração prática, teoria e análise de dados de experimentos AUC estão sendo realizadas duas vezes por ano em nosso laboratório no Instituto Nacional de Saúde [4].
Acknowledgments
Agradecemos o apoio de pesquisa pelo Programa de Pesquisa Intramural de NIBIB, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
