Summary
Аналитической ультрацентрифуге (AUC) образца ячейка содержит образцов и эталонов буфера и в ходе экспериментов и подвергается воздействию высокого вакуума и ротора со скоростью до 60000 оборотов в минуту. Это видео будет демонстрировать строгим вниманием к деталям необходимые для сборки, погрузки и выравнивание этого очень важная составляющая эксперимента AUC.
Abstract
Аналитической ультрацентрифуге (AUC) является мощным инструментом, который биофизических позволяет записывать профили макромолекулярных осаждения центрифугированием при высокой скорости. При правильно спланирована и проведена, скорости осаждения или AUC эксперимент седиментации равновесия может выявить много о белка в отношении размера и формы, образец чистоты, коэффициент седиментации, олигомеризации государств и белок-белковых взаимодействий.
Этот метод, однако, требует строгого уровень технической внимания. Пример клетки провести секторный кусок центре между двумя сборками окна. Они запечатаны с крутящим моментом давлении около 120-140 в / кг. Буфера ведения и образец загружаются в центральную секторов, а затем после герметизации, клетки точно выстраиваются в титановой ротор так, чтобы оптические системы обнаружения сканирования и образцов и эталонов буфера в той же радиальной средней линии пути через каждый центральный сектор вращаясь со скоростью до 60 000 оборотов в минуту и при очень высоком вакууме
Мало того, что правильный монтаж ячейки образец критического, компоненты кюветы очень дороги и должны быть должным образом заботились, чтобы убедиться, что они находятся в оптимальном рабочем состоянии, чтобы избежать утечки и поломки в процессе экспериментов. Ручка окна тщательно, потому что даже малейшая трещина или царапина может привести к поломке в центрифуге. Контакта между центральным и окна должны быть как можно плотнее, т.е. кольца Ньютона не должны быть видны после крутящий момент давление. Пыль, волокна, царапины и масла с обеих окнах или центральным всех компромиссом этого контакта и может очень легко привести к утечке решений из одного сектора в другой или утечки из центральной все вместе. Мало того, что драгоценные образцы потеряли, утечки решений во время эксперимента вызовет дисбаланс давления в клетке, что часто приводит к разбитые окна и центральные части. Кроме того, плагин прокладки и жилищно зажигания должны быть надежно в месте, чтобы избежать решения время вытащил из центрального сектора через загрузку дырок высокого вакуума в камере центрифуги. Окно лайнеров и прокладки должны быть свободны от разрывов и трещин, которые могут вызвать движение в результате чего разбитые окна.
Это видео будет демонстрировать наши процедуры образца сборки ячейки, крутящий момент, погрузки и ротора выравнивание чтобы свести к минимуму повреждения компонентов, решение утечки и поломки во время идеальный эксперимент AUC.
Protocol
Пример Ассамблеи сотовый и крутящий момент
- Мы начинаем строительство кюветы, поставив вместе две сборки окна.
Место окно прокладки в окно держателя. Расположите окна лайнера (или его иногда называют окном подушке) внутри окна держатель так, что открытие лайнера находится напротив паза владельца. Под небольшим углом, место окна в держатель выравнивания писец след в окно с ключевыми способ окна владельца. Пресс мягко на самых краев по обе стороны окна. - Для обеспечения надлежащей герметизации и точный крутящий момент в кюветы, мы слегка пальто прокладка жилья и винт кольцо с Spinkote смазки. Распространение очень небольшое количество Spinkote между большим и указательным пальцами. Резьбу винта кольца с тонкой, невидимой пленкой Spinkote. Кроме того, пальто жилья прокладки. Вытрите видимых смазки.
- Начало сборки кюветы, сдвинув один оконный блок, с окном вверх по отношению к вам, в клетку жилья, совместив паз с жильем ключ. Выровнять по центральным пазом с жильем ключ и пусть она плавно опускаются на верхней части окна сборки внутри клетки.
- Никогда не используйте какой-либо инструмент настаивать центральным в клетку жилья. Это может привести к необратимому повреждению СР в результате утечки в процессе экспериментов. Включите второй сборки окна так, чтобы окно, обращенной к центральным, вдали от вас, совместите паз с жильем ключ и сдвиньте ее вниз в верхней части центральной части. Место жилья прокладки на вершине, то, винт кольцо так, слово "Out" видна. С помощью пальцев и выравнивание инструмент, ручной затянуть винт кольца.
Если СР не скользит легко в жилье баррель, во-первых выровнять его, а затем, место второго окне сборки на нем. Применяя нежный понижательное давление на оконный блок, слайд как в клетку жилья в то же время. Таким образом, мы избегаем нажатием непосредственно на CP.
Сейчас самое подходящее время, чтобы заглянуть внутрь ячейки для пыли, пуха и отпечатки пальцев. Вы также заметите, кольца Ньютона, которые указывают на все еще воздух между СР и окон. Они будут исчезать после применения крутящего момента. - С винтом кольцо и слово «аут» видно, место кюветы весь путь вниз внутри цанги ячейки крутящий момент крутящий момент стенд. Держите ячейку в месте, применяя постоянное давление на ручку стоять крутящего момента. В одном непрерывном движении, затяните винт кольца между 120-140 дюйм-фунт. При использовании разводной ключ крутящего момента микрометра, установите его между 120-140 в / кг и затянуть винт кольцо, пока ключ "клики" с указанием множества крутящий момент была достигнута. Отпустите ручку крутящий момент встать и осторожно удалите кюветы, не касаясь окна.
Загрузка и уплотнительные кюветы
- Для экспериментов скорости седиментации, мы обычно нагрузка объемом 400ul в каждом секторе 12мм центральным использованием 200ul пипетки. Поместите кювету с загрузкой отверстий на верхней и слово «аут» на винт кольца видны. Слайд половину пипетки путь вниз в левый сектор центральным через загрузочный отверстия и медленно обойтись 200ul ведения решение. Повторите еще раз к общему 400ul. Используя тот же наконечник пипетки и ту же технику, тщательно и медленно заполнить правый сектор с центральным 400ul раствора пробы.
Объемы 150-180 ул используются для экспериментов седиментации равновесия, но такой же тщательностью и техника должны быть соблюдены.
Крайне важно, чтобы соответствовать объемам ведения и образцы решений как можно ближе. Установка пипетки твердо на пипетку, медленно погрузки и выдачи решения, избегая загрузки пузырьков и с использованием тех же наконечником пипетки для обоих решений всей помощи в сохранении объемов как равные, насколько возможно. - Уплотнение ячейки путем размещения 2 новых красных прокладки корпуса разъема уютно в каждой загрузкой отверстие убедившись, что они расположены между центром и кусок алюминия. Обложка каждого корпуса разъема. Рука затянуть с небольшой плоской отверткой.
Пример сотовый Выравнивание в Ротор
- Перед загрузкой ротора, убедитесь, что противовеса составляет не более 0,5 г легче, чем образец ячейки в противоположную позицию в случае, если утечка кюветы. Начните с баланса на нуле. Первые весят кюветы, которые будут в положении противоположном ЦБ. Тара баланса вычесть вес образца ячейке, а затем, весят ЦБ. Сложение и вычитание веса от привязанности отверстие противовес. Убедитесь, что вес не выступают с самого верха. Reweigh для того, чтобы уравновесить конечный вес находится в пределах 0,5 г легче, чем противоположное ячейку образца.
- Использование 4-местный ротор, место в противовес позиции 4 так, чтобы белая стрелка видна и указывая в тОн направлении центробежной силы. Убедитесь, что он все время вниз внутри ротора. Аккуратно закрепите винт, нашел на вершине противовеса через дорогу от белой стрелки, пока противовес прочно на месте, но все еще в состоянии быть выровнены. Позиция сбалансированной ячейки образца с жильем пробки перед центром ротора и слово «аут» на винт кольца видны.
- Глядя из-под ротора, выравнивание внутри знак писцу (марка ближе к центру ротора) с писцом след в противовес использованием выравнивания разделов. Затяните винт для блокировки выровнены противовеса на месте. Таким же образом, выравнивание писец образца знаком ячейки с отметкой внутри писцом в позиции 2 на роторе.
Дополнительные сведения см. в https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
Надлежащей сборке клетки, проба вставки и выравнивание ячеек в роторе имеет решающее значение для высокого качества экспериментов AUC. Это относится, в частности, для экспериментов, которые требуют очень детального анализа полученных данных по профилям макромолекулярных осаждения, например, при изучении белковых взаимодействий и определения следовых количествах совокупности. Зачастую качество экспериментальной установки является предельным для точности и точности результатов исследования AUC. Более подробную информацию о практической разработки и дальнейшего выполнения экспериментов AUC, см. ссылки 1 - 3. Семинары по практической установки, теории и анализа данных экспериментов AUC проводятся два раза в год в нашей лаборатории при Национальном институте здоровья [4].
Acknowledgments
Мы признаем, поддержки исследований по Внутренние программы исследований NIBIB, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
